실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링
Summary
여기에 보고된 감염한 세포의 전기 임피던스 에 대한 실시간 모니터링을 이용한 전염성 바이러스 입자의 정량화를 위한 프로토콜이 있다. 이 방법의 실용적인 적용은 환경 조건을 모방하는 다른 물리화학 적 매개 변수하에서 인플루엔자 A 바이러스 부패를 정량화하여 제시된다.
Abstract
바이러스 입자 정량화에 대한 방법은 많은 바이러스학 연구의 중요한 측면을 나타냅니다. 몇 가지 신뢰할 수 있는 기술이 존재하지만 시간이 많이 걸리거나 작은 변형을 감지할 수 없습니다. 여기에 제출된 것은 감염된 세포의 전기임피던스 변이를 실시간으로 분석하여 바이러스 성 티터의 정확한 정량화를 위한 프로토콜이다. 세포 임피던스는 마이크로 플레이트의 세포 아래에 위치한 금 마이크로 전기 전전자 바이오 센서를 통해 측정되며, 크기는 세포의 수와 크기와 모양에 따라 달라집니다. 이 프로토콜을 사용하면 향상된 감도로 세포 증식, 생존 가능성, 형태 학 및 마이그레이션을 실시간으로 분석할 수 있습니다. 또한 시간이 지남에 따라 바이러스 감염에 영향을 미치는 다양한 물리화학 적 매개 변수 (즉, 온도, 염도 및 pH)에 제출 된 인플루엔자 A 바이러스 (IAV)의 부패를 정량화하여 실용적인 응용 프로그램의 예가 제공됩니다. 이러한 응용 프로그램의 경우 프로토콜은 전염성 바이러스 입자의 정확한 정량화 데이터를 생성하는 동시에 필요한 워크로드를 줄입니다. 그것은 주어진 환경에서 지속 할 수있는 용량을 반영하는 다른 IAV 사이의 불활성화 슬로프의 비교를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수행하기 쉽고, 매우 재현 가능하며, 세포 배양에서 세포 병증 효과를 생성하는 모든 바이러스에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
바이러스의 전송은 몇몇 요인의 조합에 의존합니다. 환경에서 분비된 바이러스의 경우, 전송은 호스트 외부의 조건에서 지속되는 능력에 따라 달라집니다. 일반적으로 바이러스 성 불활성화를 연구하는 것은, 그러므로, 국가 보건 당국과 정책 입안자가 통제 및 생물 안전 조치를 실행하는 것을 돕는 중요한 단계입니다.
자연 및 실험실 설정에서 바이러스 지속성에 대 한 지식은 지난 10 년 동안 상당히 증가 했다. 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 경우, 이들의 전송 경로는 광범위한 환경 조건에 바이러스 입자를 제출합니다. 구체적으로, 1) 배설구 경로를 통해 물(즉, 조류 바이러스) 또는 2) 오염된 포미트뿐만 아니라 에어로졸 및 호흡기 방울(즉, 가금류 및 포유류 바이러스)에 의한 직접 또는 간접 접촉을 통해 전달될 수 있다. 어쨌든, IAV는 다양한 물리화학적 매개변수(즉, pH, 염분, 온도 및 습도)에 제출되며, 이는 감염성에 다소 빠르게 영향을 미칩니다2,3,4,5,6,7,8,9. 특히 동물노닉 및 전염병 바이러스에 관한 매우 중요하며, 바이러스 역학에 영향을 미치는 환경 요인의 잠재력과 노출 및 종 간 전염의 위험을 평가하는 것이 매우 중요합니다.
지금까지, 전통적인 바이러스학 기술 (즉, 플라크 애스터또는 50% 조직 배양 전염성 용량 추정을 통해 바이러스 성 titer 결정) 시간이 지남에 따라 IAV 감염성을 평가하는 데 사용되었습니다; 그러나 이러한 기술은 시간이 많이 소요되며 많은 공급이 필요합니다10,11,12. 감염된 세포를 마이크로 전극으로 시간이 지남에 따라 임피던드를 측정하는 것은 일반적으로 바이러스 성 불활성화뿐만 아니라 다른 환경 조건에서 IAV 생존을 모니터링하는 유용한 도구역할을합니다. 이 방법은 세포 병증 효과의 주관적인 인간 관찰을 대체하는 객관적인 실시간 데이터를 제공합니다. 그것은 바이러스 적정을 결정하는 데 사용할 수 있습니다, 따라서 낮은 신뢰 간격으로 기존의 측정을 대체하고 노동 집약적 인 엔드 포인트 측정을 피할 수 있습니다.
선형 상관 관계는 세포 임피던드의 측정과 고전적인 플라크 분석또는 TCID50 방법에 의해 얻어진 적정 결과 사이에 존재한다. 따라서, 임피던스 기반 적정 법으로 얻은 데이터는 바이러스의 직렬 희석을 이용한 표준 곡선을 생성하여 TCID50 또는 pfu 값에서 쉽게 변형될 수 있다13,14,15,16,17. 혈청 시료에 존재하는 항체중화의 검출, 정량화 및 효능또한 이러한 실험접근법18,19를 사용하여 달성될 수 있다. 최근에는 임피던스 기반 세포 소가 Equid alphaherpesviruses20에 대한 항바이러스 화합물을 선별하고 평가하는 데 사용되었습니다.
이 기술은 다른 온도에서 식염수에서 IAV의 지속성을 평가하고 환경에서 IAV 지속성을 증가또는 감소IAV의 헤마글루티닌에서 돌연변이를 식별하는 데 사용되었습니다21. 이러한 심사는 전통적인 적정 방법을 사용하는 경우 광범위한 작업이 필요합니다. 그러나, 이 방법론은 세포 형태, 세포 수 및 세포 표면 부착 강도에 영향을 미치는 모든 바이러스에 사용될 수 있다. 또한 다양한 환경 조건(예: 공기, 물 또는 표면)에서 지속성을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에 설명된 프로토콜은 물에 IAV 생존을 예로 적용합니다. 인간 인플루엔자 바이러스는 장기간 다른 물리화학 적 매개 변수에 노출됩니다. 식염수(35g/L NaCl)의 35°C에서 의 물은 이전 결과에 기초하여 환경 모델로 선택되었다9. 노출된 바이러스의 잔류 감염성은 세포 감염을 통해 상이한 시점에서 정량화된다. IAV 증폭을 위한 기준 세포 형인 MDCK 세포는 마이크로 전광제 센서로 코팅된 16개의 잘 된 마이크로티터 플레이트에 시드되고 24시간 후에 노출된 바이러스에 의해 감염된다. 세포 임피던스는 매 15분마다 측정되고 세포 지수(CI)라고 불리는 임의단위로 표현된다. 인플루엔자 바이러스에 의해 유도된 세포요법 효과는, 그 개시의 비율은 세포 배양에 접종된 전염하는 바이러스성 입자의 수에 직접적으로 의존합니다, CI 감소로 이끌어 내고, 이는 그 후에 CIT50 값으로 정량화됩니다. 이 값은 초기 CI(즉, 바이러스 첨가 전)로부터 50% 감소를 측정하는 데 필요한 시간에 해당합니다. 여러 환경 노출 시간에 대해 계산된 CIT50 값은 CIT50 값의 선형 회귀 후 바이러스의 불활성화 경사를 공제할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
RTCA는 세포 준수, 증식, 마이그레이션 및 세포 독성과 같은 세포 특성의 실시간 모니터링에 점점 더 많이 사용되는 임피던스 기반 기술입니다. 이 연구에서는, 호스트 외부의 IAV 생존을 평가하는 이 기술의 능력은 바이러스 불활성화 경사를 측정하여 입증된다. TCID50 및 플라크 애세와 같은 까다로운 기술은 세포 생존가능성에 대한 객관적인 실시간 평가로 대체되므로 바이러스에 의해 유?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 0.25%Trypsin | ThermoFisher | 25200056 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Falcon | 430641U | |
| E-Plate 16 (6 plates) | ACEA Biosciences, Inc | 5469830001 | E-plates are avalible in different packaging |
| FCS | Life technologies (gibco) | 10270-106 | |
| MEM 1X | Life technologies (gibco) | 31095029 | |
| PBS 1X | Life technologies (gibco) | 14040091 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies (gibco) | 11548876 | |
| TPCK-Trypsin | Worthington | LS003740 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis Instrument S16 | ACEA Biosciences, Inc | 380601310 | The xCELLigence RTCA S16 instruments are available in different formats (16-well, 96-well, single or multi-plate) |
Riferimenti
- Killingley, B., Nguyen-Van-Tam, J. Routes of influenza transmission. Influenza and Other Respiratory Viruses. 7, 42-51 (2013).
- Sooryanarain, H., Elankumaran, S. Environmental Role in Influenza Virus Outbreaks. Annual Review of Animal Biosciences. 3 (1), 347-373 (2015).
- Keeler, S. P., Dalton, M. S., Cressler, A. M., Berghaus, R. D., Stallknecht, D. E. Abiotic factors affecting the persistence of avian influenza virus in surface waters of waterfowl habitats. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2910-2917 (2014).
- Stallknecht, D. E., Kearney, M. T., Shane, S. M., Zwank, P. J. Effects of pH, temperature, and salinity on persistence of avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 34 (2), 412-418 (1990).
- Poulson, R. L., Tompkins, S. M., Berghaus, R. D., Brown, J. D., Stallknecht, D. E. Environmental Stability of Swine and Human Pandemic Influenza Viruses in Water under Variable Conditions of Temperature, Salinity, and pH. Applied and Environmental Microbiology. 82 (13), 3721-3726 (2016).
- Zhang, G., et al. Evidence of influenza A virus RNA in Siberian lake ice. Journal of Virology. 80 (24), 12229-12235 (2006).
- Nazir, J., et al. Long-Term Study on Tenacity of Avian Influenza Viruses in Water (Distilled Water, Normal Saline, and Surface Water) at Different Temperatures. Avian Diseases. 54 (1), 720-724 (2010).
- Brown, J. D., Swayne, D. E., Cooper, R. J., Burns, R. E., Stallknecht, D. E. Persistence of H5 and H7 avian influenza viruses in water. Avian Diseases. 51, 285-289 (2007).
- Dublineau, A., et al. Persistence of the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus in water and on non-porous surface. PLoS ONE. 6 (11), 28043 (2011).
- Titration of Influenza Viruses. Springer Nature Experiments Available from: https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-4939-8678-1_4 (2020)
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Influenza: Propagation, Quantification, and Storage. Current Protocols in Microbiology. 3 (1), 1-22 (2006).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and Plaque Assay of Influenza Virus in an Established Line of Canine Kidney Cells. Applied Microbiology. 16 (4), 588-594 (1968).
- Witkowski, P. T., et al. Cellular impedance measurement as a new tool for poxvirus titration, antibody neutralization testing and evaluation of antiviral substances. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (1), 37-41 (2010).
- Lebourgeois, S., et al. Development of a Real-Time Cell Analysis (RTCA) Method as a Fast and Accurate Method for Detecting Infectious Particles of the Adapted Strain of Hepatitis A Virus. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 335 (2018).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
- Charretier, C., et al. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. Journal of Virological Methods. 252, 57-64 (2018).
- Tian, D., et al. Real-Time Cell Analysis for Measuring Viral Cytopathogenesis and the Efficacy of Neutralizing Antibodies to the 2009 Influenza A (H1N1) Virus. PLoS ONE. 7 (2), 31965 (2012).
- Teng, Z., Kuang, X., Wang, J., Zhang, X. Real-time cell analysis–a new method for dynamic, quantitative measurement of infectious viruses and antiserum neutralizing activity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 364-370 (2013).
- Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
- Labadie, T., Batéjat, C., Manuguerra, J. -. C., Leclercq, I. Influenza Virus Segment Composition Influences Viral Stability in the Environment. Frontiers in Microbiology. 9, 1496 (2018).
- Wiley, D. C., Skehel, J. J. The structure and function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Annual Review of Biochemistry. 56, 365-394 (1987).
