Импеданс наяпография для минимально инвазивного измерения частоты сердечных приступов у непозвоночных на поздней стадии
Summary
Измерение частоты сердечных приступов во время термической проблемы дает представление о физиологических реакциях организмов в результате острых экологических изменений. Используя американский омар (Homarus americanus) в качестве образцового организма, этот протокол описывает использование пневматической импеданса как относительно неинвазивный и нелетальный подход к измерению частоты сердечных приступов в поздней стадии беспозвоночных.
Abstract
Температура в океанах быстро повышается в результате широкомасштабных изменений мирового климата. Поскольку физиология организма в значительной степени зависит от температуры окружающей среды, это может изменить теплофизиологические показатели в различных морских организмах. Используя американский омар (Homarus americanus) в качестве образцового организма, этот протокол описывает использование пневмоза импеданса, чтобы понять, как сердечная производительность на поздней стадии беспозвоночных меняется при остром тепловом стрессе. Протокол представляет минимально инвазивную технику, которая позволяет в режиме реального времени сбор частоты сердечных приступов во время эксперимента по наращиванию температуры. Данные легко манипулировать для создания arrhenius участок, который используется для расчета Arrhenius перерыв температуры (ABT), температура, при которой частота сердечных сокращений начинает снижаться с повышением температуры. Этот метод может быть использован в различных поздних стадиях беспозвоночных (нат., крабов, мидий или креветок). Хотя протокол фокусируется исключительно на воздействии температуры на сердечную работоспособность, он может быть изменен, чтобы понять потенциал для дополнительных стрессоров (например, гипоксия или гиперкапния) для взаимодействия с температурой, чтобы повлиять на физиологическую производительность. Таким образом, этот метод имеет потенциал для широкого применения для дальнейшего понимания того, как морские беспозвоночные реагируют на острые изменения в окружающей среде.
Introduction
В последние десятилетия увеличение ввода парниковых газов (т.е. двуокиси углерода, метана и закиси азота) в атмосферу привело к широко распространенной модели экологических изменений1. Мировые океаны быстро потепление2,3, тенденция, которая может иметь серьезные последствия для физиологии организма. Температура сильно влияет на физиологические показатели, и организмы имеют оптимальный температурный диапазон для производительности4,,5,,6. Таким образом, люди могут столкнуться с трудностями в поддержании надлежащей доставки кислорода в ткани, как температура бродячих за пределами этого диапазона. Это может привести к снижению аэробных показателей в условиях потепления температуры океана5,7.
В лабораторных условиях, метод, чтобы понять физиологические последствия изменения окружающей среды является изучение сердечной деятельности в контексте теплового стресса. Это дает представление о том, как воздействие прогнозируемых условий потепления может изменить кривые производительности5,6,6 а также потенциал для акклиматизации пластичности8. Успешно внедрены различные методы измерения частоты сердечных приступов у морских беспозвоночных. Тем не менее, многие из этих методов включают хирургическое удаление или крупные манипуляции экзоскелета и длительную имплантацию измерительных приборов99,10,,11, что вводит дополнительную нагрузку на испытительного и увеличивает время, необходимое для успешного восстановления до экспериментов. Кроме того, менее инвазивные методы (например, визуальное наблюдение, видеосъемка) могут быть ограничены ранними стадиями истории жизни, когда организмы могут быть полностью или полупрозрачными12. Кроме того, дополнительные проблемы могут быть представлены исследователям, которые не очень хорошо разбираются в более технологически продвинутых методологиях (например, наблюдения с помощью инфракрасных преобразователей или доплеровской перфузии8,11).
Этот протокол использует американский омаров (Homarus americanus) в качестве модели поздней стадии морских беспозвоночных, чтобы продемонстрировать использование пневмографии импеданса для оценки изменений частоты сердечных приступов во время эксперимента по наращиванию температуры. Импеданс пневможная включает в себя прохождение колеблющегося электрического тока (AC) через два электрода, расположенных по обе стороны от перикарда для измерения изменений в напряжении, как сердце контрактов и расслабляет13,14. Этот метод является минимально инвазивным, так как он использует небольшие электроды (т.е. 0,10-0,12 мм в диаметре), которые мягко имплантируются прямо под экзоскелет. Наконец, он обеспечивает оценку в режиме реального времени как частоты сердечных приступов, так и температуры воды во время рампы с помощью регистратора данных.
Протокол также содержит инструкции по расчету температуры разрыва Arrhenius (ABT), температура, при которой частота сердечных сокращений начинает снижаться с повышением температуры13,15. ABT служит нелетальным индикатором теплового предела емкости в испытуемых, которые могут быть благоприятствования над измерением критического теплового максимума (CTмакс, верхний предел сердечной функции5,6), как смертельные пределы часто экстремальные и редко встречаются в естественной среде5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает использование пневмографии импеданса для измерения изменений частоты сердечных приступов беспозвоночных поздней стадии во время эксперимента по наращиванию температуры. Основное преимущество этого метода по сравнению с другими лабораторными подходами<sup clas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Пола Роусона за лабораторную помощь и награду Национального научного фонда IIA-1355457 мэнскому EPSCoR в Университете штата Мэн за средства на приобретение оборудования. Этот проект был поддержан Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, номером проекта Hatch MEO-21811 через сельскохозяйственную и лесную экспериментовую станцию мэн, а также Национальной службой морского рыболовства NOAA Солтонсталл Кеннеди Грант #18GAR039-136. Авторы также благодарят трех анонимных рецензентов за их комментарии к предыдущей версии этой рукописи. Мэн сельскохозяйственных и лесных экспериментов станции Публикация Номер 3733.
Materials
| 1.6 mm (1/16 in) drill bit | Milwaukee Tool at Home Depot | 1001294900 | This is for a 1.6 mm (1/16 in) diameter drill bit. This item can be found at most home-improvement stores. |
| 38 AWG Copper Magnet Wire | TEMCo | MW0093 | This wire is used to make the wire electrode leads that are implanted into the test subjects. This listing is for a 4 oz coil of 38-gauge magnetic wire. TemCo also has 36-gauge magnetic wire that is also suitable for use in constructing wire electrodes. |
| Cyanoacrylate glue | Loctite | 852882 | This item includes a brush tip, which makes it easier to control the amount of glue used to secure electrodes to the carapace. |
| Ethanol, 70% Solution, Molecular Biology Grade | Fisher BioReagents | BP82931GAL | This reagent is used in combination with the sterile cotton balls to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Excel | Microsoft | N/A | This program is used in the protocol for organizing, manipulating, and analyzing data. It is compatible with both PC and Mac operating systems. |
| Fisherbrand 8-Piece Dissection Kit | Fisher Scientific | 08-855 | This kit includes the forceps, scissors, dissecting knife (and blades), and dissecting needle needed to accomplish the electrode implantation steps in the protocol. |
| Fisherbrand Isotemp Refrigerated/Heated Bath Circulators: 5.4-6.5L, 115V/60Hz | Fisher Scientific | 13-874-180 | This is a complete system that consists of an immersion circulator and a bath. It can be used as a temperature controlled bath or to circulate fluid externally to an application. Temperature range of this water bath is -20 to +100 °C, and the unit heats/cools rapidly and is easy to drain upon conclusion of use. |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | These swabs should be soaked in 70% ethanol before being used to disinfect the carapace prior to electrode implantation. |
| Fork Terminal, Red Vinyl, Butted Seam, 22 to 16 AWG, 100 PK | Grainger | 5WHE6 | Terminals are soldered to the magnetic wire to construct the wire electrodes. These can be purchased from a variety of home-improvement vendors. |
| Impedance converter | UFI | Model 2991 | Measures impedance changes correlated with very small voltage changes, ranging from 0.2 ohm to over 5 ohms. This model can convert impedance changes that stem from resistance, capacitance, or inductance variations, as well as a combination of all three. |
| LabChart software | ADInstruments | N/A | Purchase of the PowerLab datalogger includes the LabChart software, but a license for the software can also be directly downloaded online. LabChart allows the user to record data, open and read LabChart files, analyze data, as well as save and export files. There is a free version of the software, LabChart Reader, but users can only open and read LabChart files and analyze them (i.e., it cannot be used to record, save, or export data files). One also has the option of selecting LabChart Pro, which includes LabChart teaching modules that can be used for educational purposes. |
| LED Soldering Iron | Grainger | 28EA35 | This is a generic soldering iron that can be used to solder the magnetic wire to the fork terminals to create the wire electrodes. |
| PowerLab datalogger | ADInstruments | ML826 | There are a variety of models of the PowerLab. This catalog number is for the 2/26 model that is a 2 channel, 16 bit resolution recorder with two analog input channels, independently selectable input sensitivities, two independent analog outputs for stimulation or pulse generation and a trigger input. The PowerLab features a wide range of low-pass filters, AC or DC coupling and adaptive mains filter. This unit has a USB interface for connection to Windows or Mac OS computers and a sampling rate of 100,000 samples/s per channel. |
| Prism8 | GraphPad | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature through its “Segmental linear regression” data analysis option. This program does not require any programming and is compatible with both Mac and Windows operating systems. |
| R | R Project | N/A | This is free software for statistical computing that is compatible with UNIX platforms, as well as Windows and Mac operating systems. This program can also be used to calculate the Arrhenius Break Temperature using the “segmented” package. There are a number of tutorials and user guides available online through the r-project.org website. |
| Rosin Core Solder | Grainger | 331856 | This product has a diameter of 0.031 in (0.76 mm) and is ideal for use in soldering speaker wire (similar gauge as magnetic wire used for electrodes). |
| SAS | SAS Institute | N/A | This program provides an additional option for calculating the Arrhenius Break Temperature. However, it does require programming and is not compatible with Mac operating systems. |
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | N/A | This is the authors’ preferred program for statistical determination of the Arrhenius Break Temperature. The “Regression Wizard” is easy to use and does not require any programming. One can obtain a free 30-day trial license before purchase. However, it is compatible only with PC computers. |
| T-type Pod | ADInstruments | ML312 | Suitable for measurement of temperatures from 0-50 °C using T-type thermocouples. |
| T-type Thermocouple Probe | ADInstruments | MLT1401 | Compatible with the T-type Pod for connection. Measures temperature up to 150 °C, and is suitable for immersion in various solutions, semi-solids, and tissue (includes a needle for implantation). This product is a 0.6 mm diameter isolated probe that is sheathed in chemical-resistant Teflon and a lead length of 1.0 m. |
| UV Cable Tie, Black | Home Depot | 295813 | This is for a 100-pack of 8-inch (20.32 cm), black cable ties. However, based on the size of test subjects, smaller or larger cable ties may be needed. This item, and others like it, can be purchased at any home-improvement store. |
Riferimenti
- Stocker, T. F., et al. . Climate Change 2013: The Physical Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2013).
- Pershing, A. J., et al. Slow adaptation in the face of rapid warming leads to collapse of the Gulf of Maine cod fishery. Science. 350 (6262), 809-812 (2015).
- Smale, D. A., et al. Marine heat waves threaten global biodiversity and the provision of ecosystem services. Nature Climate Change. 9 (4), 306-316 (2019).
- Pörtner, H. O., Farrell, A. P. Physiology and climate change. Science. 322 (5902), 690-692 (2008).
- Pörtner, H. O., Bock, C., Mark, F. C. Oxygen- and capacity-limited thermal tolerance: bridging ecology and physiology. Journal of Experimental Biology. 220 (15), 2685-2696 (2017).
- Somero, G. N., Lockwood, B. L., Tomanek, L. . Biochemical adaptation: response to environmental challenges, from life’s origins to the Anthropocene. , (2017).
- Sokolova, I. M., Frederich, M., Bagwe, R., Lanning, G., Sukhotin, A. A. Energy homeostasis as an integrative tool for assessing limits of environmental stress tolerance in aquatic invertebrates. Marine Environmental Research. 79, 1-15 (2012).
- Tepolt, C. K., Somero, G. N. Master of all trades: thermal acclimation and adaptation of cardiac function in a broadly distributed marine invasive species, the European green crab, Carcinus maenas. Journal of Experimental Biology. 217 (7), 1129-1138 (2014).
- Frederich, M., Pörtner, H. O. Oxygen limitation of thermal tolerance defined by cardiac and ventilatory performance in spider crab, Maja squinado. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (5), 1531-1538 (2000).
- Metzger, R., Sartoris, F. J., Langenbuch, M., Pörtner, H. O. Influence of elevated CO2 concentrations on thermal tolerance of the edible crab Cancer pagurus. Journal of Thermal Biology. 32, 144-151 (2007).
- Walther, K., Sartoris, F. J., Bock, C., Pörtner, H. O. Impact of anthropogenic ocean acidification on thermal tolerance of the spider crab Hyas araneus. Biogeosciences. 6 (10), 2207-2215 (2009).
- Styf, H. K., Sköld, H. N., Eriksson, S. P. Embryonic response to long-term exposure of the marine crustacean Nephrops norvegicus to ocean acidification. Ecology and Evolution. 3 (15), 5055-5065 (2013).
- Camacho, J., Qadri, S. A., Wang, H., Worden, M. K. Temperature acclimation alters cardiac performance in the lobster Homarus americanus. Journal of Comparative Physiology A. 192 (12), 1327-1334 (2006).
- Braby, C., Somero, G. N. Ecological gradients and relative abundance of native (Mytilus trossulus) and invasive (Mytilus galloprovincialis) blue mussels in the California hybrid zone. Marine Biology. 148 (6), 1249-1262 (2006).
- Stenseng, E., Braby, C. E., Somero, G. N. Evolutionary and acclimation-induced variation in the thermal limits of heart function in congeneric marine snails (Genus Tegula): implications for vertical zonation. Biological Bulletin. 208 (2), 138-144 (2005).
- Factor, J. . Biology of the Lobster: Homarus americanus. , (1995).
- Muggeo, V. M. Segmented: an R package to fit regression models with broken-lin relationships. R News. 8 (1), 20-25 (2008).
- Ryan, S. E., Porth, L. S. A tutorial on the piecewise regression approach applied to bedload transport data. General Technical Report RMS-GTR-189. , (2007).
- . . Prism8 Statistics Guide. , (2020).
- Cuculescu, M., Hyde, D., Bowler, K. Thermal tolerance of two species of marine crab, Cancer pagurus and Carcinus maenas. Journal of Thermal Biology. 23 (2), 107-110 (1998).
- Stillman, J. H. A comparative analysis of plasticity of thermal limits in porcelain crabs across latitudinal and intertidal zone clines. International Congress Series. 1275, 267-274 (2004).
- Maderia, D., et al. cellular and biochemical thermal stress response of intertidal shrimps with different vertical distributions: Palaemon elegans and Palaemon serratus. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A. 183, 107-115 (2015).
- Padilla-Ramirez, S., et al. The effects of thermal acclimation on the behavior, thermal tolerance, and respiratory metabolism in a crab inhabiting a wide range of thermal habitats (Cancer antennarius Stimpson, 1856, the red shore crab). Marine and Freshwater Behaviour and Physiology. 48 (2), 89-101 (2017).
- Pörtner, H. O. Ecosystem effects of ocean acidification in times of ocean warming: a physiologist’s view. Marine Ecology Progress Series. 373, 203-217 (2008).
- Pörtner, H. O. Oxygen- and capacity-limitation of thermal tolerance: a matrix for integrating climate-related stressor effects in marine ecosystems. Journal of Experimental Biology. 213 (6), 881-893 (2010).
- Zittier, Z. M. C., Hirse, T., Pörtner, H. O. The synergistic effects of increasing temperature and CO2 levels on activity capacity and acid-base balance in the spider crab, Hyas araneus. Marine Biology. 160 (8), 2049-2062 (2013).
- Harrington, A. M., Hamlin, H. J. Ocean acidification alters thermal cardiac performance, hemocyte abundance, and hemolymph chemistry in subadult American lobsters Homarus americanus H. Milne Edwards, 1837 (Decapoda: Malcostraca: Nephropidae). Journal of Crustacean Biology. 39 (4), 468-476 (2019).
- Depledge, M. H. Photoplethysmography – a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in decapod crustaceans. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 77 (2), 369-371 (1984).
