유해 성 평가를 위한 상피 세포 및 1 차적인 면역 세포로 구성된 다세포 인간 폐포 모형

인간의 혈액에서 분리 된 기본 단핵구를 포함하는 일은 공중 위생 스위스연방사무소의 위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호: 611-1, 멜둥 A110635/2) 아돌프 머클 연구소에 대한. 1. 인간 버피 코트에서 말초 혈액 단핵구 (PBM)의 격리 참고: 다음 섹션에서는 스위스 베른의 스위스 수혈 센터에서 구입한 버피 코트 의 50mL 봉지에서 면역 세포의 분리를 설명합니다. 시약 준비 버피 코트 당 자기 분리 버퍼 100mL 준비: 0.5% [w/v] 소 혈청 알부민 (BSA; 인산염 완충식염 [PBS]) 2 mM 에틸렌디아민트라 테 트라아제산 (EDTA),와 pH = 7.2, 0.2 μm 크기의 멸균 필터에 적응하십시오. 시술 내내 4°C로 유지하십시오. 세포 배양 배지 준비(CCM): RPMI 1640 와 10% [v/v] 태아 소 혈청 (FBS), 1% [v/v] L-글루타민 (여기, 2 mM L-글루타민, 1% [v/v] 페니실린-연쇄 절제술신(여기, 100단위/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술).참고: 각 시약의 필요한 양은 다음 단계에서 시드할 셀 수에 따라 달라집니다. PBM 격리참고: 모든 유리와 플라스틱 제품은 사용하기 전에 소독해야 합니다. 안전상의 이유로, 유리 제품으로 부상의 위험을 줄이기 위해 인간의 혈액 샘플을 처리 할 때 플라스틱 제품의 사용을 권장합니다. 가위를 사용하여 버피 코트가 들어있는 가방의 호스 끝을 잘라냅니다. 가방의 덕트를 통해 가방의 내용기를 직접 50mL 튜브 2개(~25mL)에 부어 버피 코트를 배포합니다. 부드럽게 붓거나 파이프 PBS를 튜브에 붓고 50 mL 볼륨에 도달합니다. 튜브를 3배 거꾸로 부드럽게 돌려 내용들을 섞는다. 버피 코트-PBS 혼합물을 4개의 새로운 50mL 원심분리기 튜브에 나누어 각 신선한 튜브에 혼합물의 25mL를 피펫팅하여 나눕니다. 10mL 세로지컬 파이펫을 사용하여 버피 코트-PBS 혼합물 아래에 밀도 그라데이션 배지 13mL을 천천히 놓습니다. 파이펫 홀더에서 채워진 파이펫을 분리하고 즉시 피펫의 상부 개구부를 엄지 손가락으로 연결하여 밀도 그라데이션 매체의 추가 누출을 방지하여 버피 코트-PBS 혼합물로 섞어줍니다.참고: 엄지 손가락으로 상부 개구부를 잡고, 채워진 파이펫을 원물 원심분리기 튜브의 바닥에 놓고 밀도 그라데이션 매체가 버피 코트-PBS 혼합물 아래에 서서히 흐르게 하여 파이펫 내부에 밀도 그라데이션 배지의 약 1mL를 남깁니다. 버피 코트-PBS 혼합물을 포함하는 다른 3개의 튜브와 함께 1.2.5단계를 반복한다. 원심분리기는 1,000xg에서 20분, 25°C의 혼합물을 포함하는 4개의 튜브를 슬로우 제동 모드에서 모두 분리한다. 원심 분리를 위해 보호 뚜껑이 있는 홀더를 사용하십시오. 각 튜브의 뚜껑을 열고 혈장 과혈피를 사용하여 플라즈마와 혈소판을 포함하는 상부 층을 제거하고 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 폐기하십시오. 혈장과 밀도 그라데이션 중간 층 사이의 희끄무레한 탁탁작은 분수(두께~2~3mm)로 나타나는 말초 혈액 단핵 세포 층을 수집하기 위한 세로지학적 파이펫을 사용합니다. 펠릿에는 바닥에 적혈구가 포함되어 있습니다. 가장 하위 계층을 형성하는 적혈구를 옮기지 마십시오. 네 개의 튜브 모두에 대해 이 것을 반복합니다.참고: 말초 혈액 단핵 세포는 PBM 및 림프구로 구성됩니다. PBM은 자기 CD14+ 분리 중에 나중에 림프구에서 분리됩니다. 4개의 튜브에서 2개의 50 mL 관으로 말초 혈액 단핵 세포를 풀. PBS로 두 개의 튜브를 50mL로 채우고 뚜껑으로 덮습니다. 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 원래 4개의 튜브에서 남은 적혈구와 플라즈마를 폐기하십시오. 원심 분리기는 일반 원심분리기 속도로 500 x g및 18-20 °C에서 8 분 동안 두 튜브를 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 세로지학적 파이펫으로 상체를 제거하고 생물학적 위험 액체 폐기물 용기에 버려십시오. 혈청 피펫을 사용하여 PBS의 5mL로 세포를 다시 중단합니다. 셀 서스펜션을 50mL 원심분리기 튜브로 풀을 풀고 PBS로 50mL로 채웁니다. 셀 서스펜션의 5 μL을 사용하여 트라이판 블루(45 μL) 배제 방법을 사용하여 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 피펫 10 μL 의 트라이판 블루-PBM 용액을 셀 카운터 챔버로 입력하고 표준 계수 프로토콜당 셀 수를 계산합니다. 방정식 1을 사용하여 총 셀 번호 CT를 계산합니다. 세포를 계산한 후, 1.2.13 단계에서 수행된 것처럼 50mL 튜브원심분리. CD14 양수 선택 각 튜브의 뚜껑을 부드럽게 열고 펠릿을 방해하지 않고 혈청 피펫을 사용하여 상체 파이펫을 제거하고 버립니다. 자기 분리 버퍼의 계산된 양(방정식 2)을 추가하고(여기서 1 x 107 총 셀당 완충액의 80 μL)을 추가하고 용액을 위아래로 배관하여 셀 펠릿을 다시 놓습니다. 방정식 3(여기, 1 x 107 총 셀당 10 μL)을 사용하여 CD14+ 자기 구슬 및 파이펫의 해당 부피를 사용하여 계산합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 뚜껑을 닫고 용액을 4°C에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 시, 자기 분리 버퍼로 튜브를 최대 50mL까지 채웁니다. 1.2.13 단계에서 수행된 원심분리기. 세포 펠릿을 방해하지 않고 혈청 피펫을 사용하여 상체를 흡입하고 폐기하십시오. 파이펫은 자기 분리 버퍼의 해당 양 (방정식 4; 여기, 1 x 108 셀 당 버퍼의 500 μL) 및 3 배 위아래로 파이펫을 하여 부드럽게 혼합합니다. 살균제로 분무하고 닦아 자기 분리 스테이션을 소독합니다. 자기 분리를 위한 기둥과 함께 라미나르 플로우 후드에 놓습니다. 자기장에 자기 분리 컬럼을 놓고 세척 및 라벨이 없는 세포(즉, 폐기물)를 수집하기 위해 기둥 아래에 빈 50mL 원심분리기 튜브를 배치합니다. 자기 분리 버퍼 3mL을 컬럼으로 파이프하여 자기 분리 열을 헹구는 다. 절차 전반에 걸쳐 컬럼이 건조하지 마십시오. 자기 분리 버퍼의 15 mL 원심 분리 튜브 및 파이펫 1 mL을 준비합니다. 자기 분리 컬럼에 셀 서스펜션(1.3.8 단계에서 제조)을 적용합니다. 필터 아래 50mL 원심분리기 튜브에서, 통과 된 라벨이없는 세포를 수집합니다.참고: 열의 차단을 피하기 위해 열당 2 x 109 셀을 초과하지 마십시오. 컬럼 저장소가 비어 있는 즉시(즉, 셀이 컬럼을 통과한 경우)을 복사 파이펫을 사용하여 자기 분리 버퍼 3mL을 적용하고 컬럼을 통과하게 합니다. 이 3x를 반복합니다. 손으로 부드럽게 당기면 자기 분리기에서 자기 분리 열을 제거한 다음, 자기 분리 버퍼의 사전 파이프 1 mL을 포함하는 15 mL 튜브에 놓습니다 (1.3.12 단계에서 준비됨). 5mL의 자기 분리 버퍼를 컬럼에 추가하고 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 마그네틱 으로 표시된 셀을 플러시합니다. MDM 및 MDDC 차별화에 대한 시약 준비 1.2.17 단계에서 수행된 것처럼 trypan 파란색 제외 방법을 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다. 다음과 같은 추가 단계에 대한 CCM 또는 FBS의 필요한 부피를 계산합니다: 1 x 106 셀/mL(단계 1.5.1)의 세포 밀도에 대응하는 CCM의 부피 또는 FBS의 0.9mL 당 6 x 106 세포의 세포 밀도에 대응하는 FBS의 부피(단계 1.6.3). 뚜껑을 닫고 튜브를 원심분리기에 놓고 원심분리기를 1.2.13 단계에서 수행한 대로 배치합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상체를 제거하고 버립니다. 세포 파종 또는 세포 동결을 위한 1.6단계로 진행한다. MDM 및 MDDC로의 PBM 파종 및 차별화 3배 위아래로 피펫팅하여 1.4.2단계(여기서, 1 x 106 셀/mL의 최종 농도)에서 계산된 CCM의 계산된 부피에서 셀 펠릿을 재연한다. 피펫은 혈청 피펫을 사용하여 별도의 원심분리기 튜브에서 MDM 및 MDDC로 분화하기 위한 세포 수를 피펫한다. 파이펫 차별화 요소는 PbM을 사용하여 CCM에 차별화하고 위아래로 파이펫을 하여 잘 섞습니다. 차별화 요소는 다음과 같이 적용됩니다. MDDC의 경우: 최종 농도 10 ng/mL 인터류신-4 (IL-4) 및 10 ng/mL 과립-대식세포 콜로니-자극 계수(GM-CSF). MDM의 경우: 10 ng/mL 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)의 최종 농도. 3mL의 현탁액을 웰당 분배하여 6웰 플레이트에 첨가된 분화 인자를 가진 CCM의 세포 현탁액을 피펫한다(3 x 106 셀/웰, 즉 1 x 106 셀/mL에 해당). 6웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하고 CCM을 새로 고치지 않고 6일 동안 분화하게 한다.참고: 차별화 범위는 버피 코트및 실험용 설정의 현지 가용성에 따라 5~8일 범위이며, 적절한 기술을 사용하여 차별화 효율이 결정되는 경우(토론 섹션을 참조). PBM 동결 냉동 보호 매체에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단 (여기, FBS 및 디메틸 황산화물 [DMSO; cytotoxic]) 의 비율로 9:1 (v/v) 예비 FBS의 부피를 파이프로. 이는 6 x 106 셀/mL의 최종 세포 농도에 해당하며, 10% DMSO(v/v)의 추가 첨가를 고려한다. 라미나르 플로우 후드에서 원하는 극저온 수를 표시합니다(예: 날짜, 격리 코드 및 셀 수를 기록). 파이펫 0.9 mL의 순수 FBS에서 의 세포 현탁액 (여기, FBS의 0.9 mL에서 6 x 106 세포) 각 극저온에. 그 후, DMSO의 0.1 mL을 천천히 피펫하고 극저온을 3배 위아래로 돌려 서스펜션을 잘 섞는다. 극저온을 세포 동결 용기로 옮기고 즉시 24시간 동안 -80°C로 설정한다. 24시간 후, -80°C 냉동고 및 용기로부터 극저온을 제거하고 세포 저장에 적합한 액체 질소 탱크에 넣습니다. MDM 및 MDDC로의 PBM 해빙 및 차별화 필요한 모든 시약을 수조에서 37°C로 데우세요(~20~30분). 해동 된 세포의 수에 해당하는 6 개의 웰 플레이트의 적절한 수를 준비하십시오 (여기서, 1.8 x 107 세포 당 1 플레이트, 즉 3 극저온). 무균 조건하에서 각 웰에 CCM의 파이펫 2 mL. 플레이트를 인큐베이터(5% CO2,37°C)에 15분 동안 배치하여 pH가 평형을 할 수 있도록 합니다. 액체 질소 탱크에서 냉동 된 세포와 극저온의 필요한 양을 가지고 부드럽게 세포 현탁액의 균일 한 해동을 보장하기 위해 37 °C 수조 (1-2 분)에 그들을 소용돌이. 수조에서 극저온을 제거하고 살균제로 오염제거하여 에이전트가 뚜껑 및 O 링과 상호 작용하지 않도록 합니다.참고: 본인의 모든 단계는 무균 조건하에서 완료되어야 합니다. 해동할 극저온 수에 해당하는 15mL 원심분리기 튜브의 적절한 수를 준비한다(여기, 6 x 106 세포/튜브). 각 튜브에 미리 워진 CCM의 파이펫 9 mL. 파이펫은 극저온의 내용내용이 CCM을 포함하는 튜브로 천천히(드롭바이드롭)한다. 뚜껑을 닫고 각 튜브에 대해 반복하며 원심분리기는 일반 원심분리기 속도로 5분 동안 200 x g로 반복됩니다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오. 혈청 피펫(3 x 106 세포/mL에 대응하는 세포 밀도)를 사용하여 위아래로 피펫을 사용하여 전동된 CCM의 2mL에서 각 튜브(1극 극저온으로부터 세포를 포함)에서 펠릿을 재연한다. 각 튜브에서, 파이펫은 이전에 준비된 CCM의 2mL를 포함하는 6개의 웰 플레이트의 2개의 우물(웰당 1mL)으로 재중단된 세포를 3 x 106 세포/웰의 세포 밀도에 도달하였다(최종 농도 1 x 106 셀/mL에 해당). 다른 모든 튜브에 대해 이 것을 반복합니다. 섹션 1.5.3에 설명된 대로 차별화를 진행합니다. 6웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하고 CCM을 새로 고치지 않고 6일 동안 분화하게 한다. 2. 인간 폐포 상피 조직의 삼중 세포 공동 배양 모델 참고: 이 섹션에서는 12개의 웰 플레이트 인서츠에 해당하는 볼륨 및 셀 번호에 대한 지침을제공합니다. 그림 1은 모델 어셈블리에 대해 제안된 타임라인을 요약합니다. 상피 세포 (A549 세포주) 파종 공급 업체 (ATTC)에 의해 제공 된 권고에 따라 상피 세포를 배양. 간략하게, CCM에서 세포를 80% 세포 수렴성(주당 약 2x-3배)으로 하위 배양한다.참고: 서브컬쳐 A549는 5-25의 통로 범위에서 A549 세포를 사용하여 공동배양 모델 조성 전에 적어도 4개의 구절을 위한. 12 개의 웰 플레이트로 미리 따뜻힌 CCM의 파이펫 1.5 mL (우물의 수는 원하는 모델 수에 해당). 멸균 핀셋을 사용하여 12웰 플레이트의 우물에 개별 12 웰 세포 배양 삽입을 배치합니다. 하위 배분 프로토콜에 따라 플라스크에서 세포를 분리한다(즉, 분리제를 사용하여, 1.2.13 단계에서 수행된 것과 마찬가지로 원심분리에 의한 에이전트를 제거). A549의 최종 세포 농도에 해당하는 CCM의 적절한 부피에서 재중단(여기, 50 x 104 셀/mL; 삽입당 세포 현탁액의 0.5 mL, 즉 27.8 x 104 셀/cm22의 종자 밀도에 해당되는 25 x 104 세포/인서트). 1mL 파이펫을 사용하여 삽입물의 정파 측에 셀 서스펜션(즉, 25 x 104 셀/인서트)의 파이펫 0.5 mL. 뚜껑으로 플레이트를 덮고 4일 동안 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에넣습니다.참고: 상대비 현미경으로 A549 세포의 합류를 정기적으로 확인합니다. MDDC 시드 MDDC를 포함하는 6개의 웰 플레이트에 부착되지 않은 세포로 CCM을 흡인. 각 웰에 신선한 예열 된 CCM 1 mL을 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 각 웰에서 분리(긁힘) 부착된 MDDC를 사용하여 기존 CCM 3mL로 우물을 부드럽게 세척하고 원뿔원 원심분리튜브에 결합합니다. 셀 서스펜션 10μL 및 트라이판 블루 용액 10μL을 사용하여 셀 카운터로 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 카운터를 사용하여 셀 을 계산합니다. 1.2.13 단계에서 수행된 바와 같이 세포 현탁액을 원심분리합니다. 재서스펜션에 필요한 CCM 볼륨을 계산합니다(방정식 5):<!– –> 필요한 MDDC 밀도 = 42 x 104 셀/mL; 각 인서트에는 6.3 x 104 세포가 필요하며, 이는 7 x 104 셀/cm2의 종자 세포 밀도에 해당합니다(여기서, 150 μL은 2.2.10 단계에서 0.9cm2에 추가).세포 재서스펜션에 대한 CCM 부피(Vm; 방정식 5): 인서츠에 A549가 자라면서 12개의 웰 플레이트의 상부 챔버에서 CCM을 부드럽게 흡인하고 폐기하십시오. 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 페트리 접시에 A549 셀로 인서트를 거꾸로 놓습니다. PBS를 장착한 원심분리기 튜브(50mL)를 준비하고 세포 스크레이퍼를 미리 적시한다. 인서트기의 기저 표면(즉, 위쪽 부분의 위쪽 부분)에서 A549 세포를 긁어 내어 인서츠의 모공을 통해 자랍니다.참고: 개별 샘플을 긁는 사이에 PBS(튜브로 제조)로 스크레이퍼를 헹구고 시술 기간 내내 젖어 두십시오. 원심분리(2.2.5단계)에 따라, 흡인 및 상복부를 폐기한 다음, 계산된 CCM(2.2.6단계) 및 파이펫을 3배 위아래로 재분산시다. 각 인서트 위에 있는 셀 서스펜션의 파이펫 150 μL은 인서트의 전체 기저 표면이 액체로 동일하게 덮여 있고 기포를 포함하지 않도록 합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 세포 배양 인큐베이터에 70 분 동안 배치하십시오. 세포 배양 판(인서트가 처음 배치된 곳)에서 CCM을 흡인하고, 생물학적 위험 액체 폐기물로 폐기하고, 각 우물에 신선한 CCM1.5mL의 파이펫을 버린다. 뚜껑으로 플레이트를 덮고 셀 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에놓습니다.참고: 세포를 건조하지 않도록 위에서 언급한 기간을 초과하지 마십시오. 인큐베이션 후, 각 인서트를 멸균 핀셋으로 조심스럽게 잡고 CCM을 포함하는 접시에 일반 위치에 놓습니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 셀 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO2)로돌려놓습니다. 대식세포(MDM) 파종 미리 분화된 MDM이 들어 있는 6개의 웰 플레이트를 사용하여 셀 인큐베이터에서 라미나르 플로우 후드로 배치합니다. 6개의 웰 플레이트에서 자라는 미부착 MDM과 각각 의 상쾌한 프리워드 CCM1mL로 CCM을 흡입하고 폐기하십시오. 셀 스크레이퍼를 사용하여 개별 우물에서 부착 된 MDM을 부드럽게 제거하십시오 (MDDC의 경우 2.2.3 단계에서 수행됨). 피펫 10 μL의 트라이판 블루는 우물 또는 튜브에 넣고 MDM 서스펜션의 10 μL을 추가하여 1:1 (v/v)의 최종 희석을 달성합니다. 적절한 계수 프로토콜을 사용하여 MDM 수를 계산합니다. 1.2.13 단계에서 수행된 바와 같이 세포 현탁액을 원심분리합니다. 필요한 볼륨을 계산합니다(방정식 6):필요한 MDM 밀도 = CCM에서 2.5 x 104 셀/mL(여기서 각 삽입은 0.5mL CCM에서 1.25 x 104 셀이 필요하며, 이는 1.4 x 104 셀/cm2의종자 세포 밀도에 해당한다).(6) 원심분리시, 흡인 및 상체를 폐기하면, 계산된 CCM(2.3.6단계) 및 파이펫을 3배 위아래로 재분산시한다. 1mL 파이펫을 사용하여 A549 및 MDDC(상피 세포에 직접 가하지 않음)를 이용한 세포 배양 인서트의 벽에 MDM 서스펜션(2.3.7단계에서 제조)의 조심스럽게 파이펫 0.5 mL. 24h용 세포배양배양배기(37°C, 5%CO2)에뚜껑을 덮고 놓는 플레이트를 덮는다. 공액 인터페이스(ALI)로 의 공동 문화 모델 이전 세포 배양 인큐베이터에서 조립된 모델의 24h(±2h) 배양 기간이 끝나면 세포 배양 삽입물의 정모 및 기저 부위모두에서 CCM을 흡인 및 폐기한다. 멸균 핀셋을 사용하여, 1mL 파이펫을 사용하여 각각 의 우물과 파이펫 0.6 mL의 개별 인서트를 들어 올립니다. 인서드의 정점에 CCM을 추가하지 마십시오. 뚜껑이 있는 덮개 플레이트와 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에배치하여 24시간 전에 추가 사용한다. 3. 선택된 양수 컨트롤에 노출 (염증 반응을 유도하기위한 알려진 자극) 참고: 알려진 프로염증 자극 내독소 리포시아당카라이드(LPS)7 및 프로염증성 사이토카인 종양 괴사 인자 α(TNF-α)7에 대한 균양 모델의 노출은 모델의 반응성을 예시하는 데 사용된다. 더욱이, 세제(Triton X-100)에 노출되면 락테이트 탈수소효소(LDH) 분석의 민감도를 확인하는 데 사용된다. 양수 제어 솔루션 준비: LPS 스톡(증류수 1 mg/mL), TNF-α 스톡(증류수100 μg/mL) 및 트리톤-X 100(PBS의 2% [v/v]). ALI 조건에서 공동 문화 모델의 24 시간 인큐베이션에 따라, 흡인 및 기저 구획에서 상퍼를 폐기. 멸균 핀셋을 사용하여 우물과 파이펫 0.6 mL의 개별 인서트를 각 우물에 들어올립니다. 1 μg/mL LPS, 1 μg/mL TNF-α, 0.2% 트리톤-X 100 : 다음과 같이 원적 원심 분리튜브에서 CCM의 주식을 희석하여 개별 긍정적 인 제어 작업 솔루션을 준비합니다. 볼륨은 테스트된 인서츠 수(여기 100 μL/삽입)에 해당합니다. 3배 위아래로 파이프를 사용하여 솔루션을 잘 섞습니다. 셀 배양 삽입의 벽에 천천히 피펫팅하여 각 양수 제어 용액의 100 μL을 적용하십시오. 24h용 세포배양배양(37°C, 5%CO2)에뚜껑을 덮고 배치한다. 인큐베이션 시 핀셋을 사용하여 개별 인서트를 보유하여 삽입물의 정물 측에 액체를 흡인하고 폐기하십시오. 기저 구획에서 CCM을 수집하고 추가 LDH 분석을 위해 1) 4°C에 저장하고, 세포막 파열 매개 세포 독성을 나타내는 및/또는 2) 효소 연계 면역소벤터벤트 분석(ELISA)을 통한 단백질 방출의 추가 분석을 위해 -80°C에 저장한다. 키트 공급 업체 의 권고에 따라 assays를 실행합니다. CCM을 제거하면, PBS 3x로 인서트를 세척하고 두 삽입면 PFA 용액으로 잘 덮여 있는지 확인하여 세포 배양 인서트에 세포를 4 % [w /v] 파라 포름알데히드 (PBS, 실온에서 15 분)로 고정하십시오. 이후 PBS로 3배 세척하여 PFA를 제거합니다. 추가 면역 스테인닝을 위해 PBS에 침수된 샘플을 4°C에서 저장합니다(이 방법의 예는 이전에17에설명되었다).