危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

ヒトの血液から分離された原発単球を含む研究は、アドルフ・メルクル研究所の連邦公衆衛生局(参照番号611-1、メルドゥンA110635/2)の委員会によって承認されました。 1. 末梢血単球(PBM)をヒトバフィーコートから分離 注:次のセクションでは、スイスのベルンにあるスイス輸血センターから購入したバフィーコートの50 mL袋から免疫細胞を単離する方法について説明します。 試薬の調製 バフィーコートあたり100 mLの磁気分離バッファーを準備する:0.5%[w/v]牛血清アルブミン(BSA;リン酸緩衝生理食塩分[PBS])を2 mMエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)で、pH = 7.2、0.22 μmの細孔サイズの無菌フィルターに調整します。手順を通して4°Cに保ちます。 細胞培養培地(CCM):RPMI 1640に10%[v/v]ウシ胎児血清(FBS)、1%[v/v]L-グルタミン(ここでは2mM L-グルタミン)、1%[v/v]ペニシリン-ストレプトマイシン(ここでは100単位/mLペミシンおよび100μCg/μcm)を使用します。注: 各試薬の必要量は、次の手順でシードされるセルの数によって異なります。 PBM の分離注:すべてのガラスおよびプラスチック製品は、使用前に滅菌する必要があります。安全上の理由から、ガラス製品による傷害のリスクを低減するために、人間の血液サンプルを取り扱う際には、プラスチック製品の使用をお勧めします。 はさみを使用して、バフィーコートを含むバッグのホースエンドを切り開きます。 袋のダクトを通して袋の中身を2つの円錐形遠心分離器50 mLチューブ(〜25 mLずつ)に直接注いで、バフィーコートを配ります。 PBSをチューブに軽く注ぐか、ピペットを50 mLの体積に達します。チューブを3倍に軽く逆さまにして内容物を混ぜます。 各新鮮なチューブで混合物の25 mLをピペット処理することにより、4つの新しい50 mL円錐遠心管にバフィーコート-PBS混合物を分割します。 10 mL血清学的ピペットを使用して、バフィーコート-PBS混合物の下に13mLの密度勾配培地をゆっくりと置きます。充填されたピペットをピペットホルダーから取り外し、すぐにピペットの上部開口部を親指で差し込み、密度勾配媒体がバフコート-PBS混合物に漏れるのを防ぎます。注:親指で上の開口部を保持し、密度勾配媒体がゆっくりとバフィーコート-PBS混合物の下に流れるように円錐遠心管の底に充填されたピペットを置き、ピペットの中に約1 mLの密度勾配媒体を残します。 バフィーコート-PBS混合物を含む他の3つのチューブでステップ1.2.5を繰り返します。 遠心分離機は、混合物を含む4本のチューブすべてを1,000xgでx g20分間、遅いブレーキモードで25°Cで行います。遠心分離のために保護蓋付きホルダーを使用してください。 各チューブの蓋を開け、血清ピペットを用いてプラズマと血小板を含む上層を取り除き、バイオハザード液体廃液容器に入れます。 血漿と密度勾配媒体層の間に白っぽい濁った小分画(厚さ約2〜3mm)として現れる末梢血単核細胞層を収集するために血清学的ピペットを使用する。ペレットは、下部に赤血球が含まれています。最下層を形成する赤血球の転移を避けてください。4本のチューブすべてに対してこれを繰り返します。注:末梢血単核細胞はPBMとリンパ球で構成されています。PBMは、磁気CD14+分離中に後でリンパ球から分離されます。 末梢血単核細胞を4本のチューブから2つの50 mLチューブにプールします。 2本のチューブをPBSで50mLまで満たし、蓋をします。 バイオハザード液体廃容器内の元の4つのチューブから残った赤血球およびプラズマを捨てます。 2本のチューブを500x g で8分間、通常の遠心分離機速度で18~20°Cの遠心分離機を使用します。 遠心分離後、血清ピペットで上清を取り出し、バイオハザード廃液容器に捨てます。 血清ピペットを用いて5mLのPBSで細胞を再懸濁する。 細胞懸濁液を1本の50 mL円錐遠心管に溜め、PBSで50mLに充填します。 細胞懸濁液の5 μLを使用して、トリパンブルー(45 μL)排除法を使用してセルカウンターで細胞をカウントします。 トリパンブルーPBMs溶液のピペット10 μLをセルカウンターチャンバに入れ、標準のカウントプロトコルに従ってセル数をカウントします。数式 1 を使用して、セルの合計数である CTを計算します。 細胞を数えた後、ステップ1.2.13で行われたように50mLチューブを遠心分離する。 CD14 ポジティブセレクション 各チューブの蓋をそっと開け、ペレットを邪魔することなく血清ピペットを使用して上清を取り除き、廃棄します。 磁気分離バッファーの計算量 (式 2) を加え (ここでは、合計 1 x 107 セル あたりバッファーの 80 μL) を加え、溶液を上下にピペット処理して細胞ペレットを再中断します。 式3(ここでは、1 x 107 セルあたり10 μL)を使用して、対応するCD14+磁気ビーズの体積を計算し、適切な体積をピペットします。 上下にピペットを入れ、蓋を閉めて、4°Cで15分間インキュベートします。 インキュベーション時に、チューブを最大50 mLまで磁気分離バッファーで満たします。 ステップ 1.2.13 で行われた遠心分離機。 細胞ペレットを乱すことなく血清ピペットを使用して上清を吸引し、廃棄する。 ピペットの磁気分離バッファーの量(式 4;ここでは、1 x 108 セルあたりバッファーの 500 μL)、上下 3x ピペットで穏やかに混合します。 殺菌剤でスプレーして拭き取り、磁気分離ステーションを消毒します。磁気分離のための列と一緒に層流フードに置きます。 磁気分離カラムを磁界に置き、空の50 mL円錐形遠心管をカラムの下に置き、洗浄細胞とラベルなし細胞を回収します(すなわち、廃棄物)。 3 mLの磁気分離バッファーをカラムにピペット処理して、磁気分離カラムをリンスします。手順を通してカラムを乾燥させないでください。 15 mL円錐形遠心分離チューブとピペット1 mLの磁気分離バッファーを準備します。 磁気分離カラムにセル懸濁液(ステップ1.3.8で用意)を適用します。フィルターの下の50 mL円錐形遠心分離管で、通過したラベルのない細胞を収集します。注: 列がブロックされないように、列あたり 2 x 109 個のセルを超えないようにしてください。 カラムリザーバーが空になると(すなわち、細胞がカラムを通過した場合)、血清学的ピペットを使用して3mLの磁気分離バッファーを適用し、カラムを通過させます。この3倍を繰り返します。 磁気分離器から磁気分離カラムを取り出し、手で軽く引っ張り、あらかじめパイプした1mLの磁気分離バッファー(ステップ1.3.12で作成)を含む15 mLチューブに入れます。 5 mLの磁気分離バッファーをカラムに加え、プランジャーをしっかりと柱に押し込んで磁気標識されたセルを洗い流します。 MDMおよびMDDC分化のための試薬調製 ステップ 1.2.17 で行われた trypan blue 除外方法を使用してセル カウンターを持つセルをカウントします。 さらに、1 x 106 セル/mL のセル密度に対応する CCM の体積(ステップ 1.5.1)、または FBS の 0.9 mL あたり 6 x 106 セルのセル密度に対応する FBS の体積 (ステップ 1.6.3) の場合は、CCM または FBS の必要なボリュームを計算します。 蓋を閉じ、チューブを遠心分離機に入れ、遠心分離機をステップ1.2.13で行います。細胞ペレットを乱さずに上清を取り除き、廃棄します。細胞の播種の場合はステップ 1.5 に進み、セル凍結の場合はステップ 1.6 に進みます。 MM および MDDc への PBM シードと分化 ステップ1.4.2で計算されたCCMの体積の細胞ペレットを再懸濁し(ここでは、1 x 106 細胞/mLの最終濃度)を3倍上下にピペット処理して下りる。 ピペットは、血清ピペットを使用して、別々の円錐型遠心管内のMDMおよびMDDCに分化することを意図した細胞の数を示す。 ピペットはPBMでCCMに因子を分化し、上下にピペットを入れることによってよく混ぜます。差別化要因は次のように適用されます。 MDDCの場合:最終濃度は10 ng/mLインターロイキン-4(IL-4)および10ng/mL顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)である。 MDMsの場合:10 ng/mLマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の最終濃度。 CCMの細胞懸濁液を6ウェルプレートに加えて、ウェルあたり3mLの懸濁液を分配して(3 x 106 細胞/ウェル、すなわち1 x 106 細胞/mLに相当する)。 6ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に2入れ、CCMをリフレッシュせずに6日間分化させます。注:差別化は、適切な技術を使用して差別化効率が決定される場合(説明のセクションを参照)、バフィーコートと実験的セットアップの局所的な可用性に応じて5〜8日の範囲です。 PBM凍結 細胞ペレットを凍結保護媒体(ここでは、FBSおよびジメチルスルホキシド[DMSO;細胞傷害性])の比で再懸濁し、プリウォームFBSの体積をピペット化して9:1(v/v)の比率で行う。これは、最終的な細胞濃度が6 x 106 セル/mLに相当し、さらに10%のDMSO(v/v)を追加することを考慮した。 層流フードのクライオビアルの所望の数をマークします(すなわち、日付、分離コード、およびセルの数を記録します)。 ピュアFBSにおける細胞懸濁液のピペット0.9mL(ここでは、FBSの0.9 mLで6 x 106 細胞)を各cryovialにする。その後、DMSOのピペット0.1mLをゆっくりと、3倍上下にクライオビシャルを回して懸濁液をよく混ぜます。 凍結を細胞凍結容器に移し、すぐに-80°Cに24時間セットします。 24時間後、-80°Cの冷凍庫と容器から凍結を取り出し、細胞貯蔵に適した液体窒素タンクに入れます。 MMSとMDDCへのPBMの解凍と差別化 必要な試薬をすべて水浴で37°C(〜20~30分)に温めます。 解凍した細胞の数に対応する6ウェルプレートの適切な数を準備します(ここでは、1.8 x 107細胞あたり1プレート、すなわち3クリボシャル)。無菌条件下で各ウェルにCCMのピペット2 mL。プレートをインキュベーター(5%CO2、37°C)に15分間置き、pHを平衡化させます。2 液体窒素タンクから凍結した細胞で必要な量の凍結を取り、37°Cの水浴(1〜2分)で静かに渦巻き、細胞懸濁液の均一な解凍を確実にします。 水浴から凍結を取り除き、殺菌剤で除染し、薬剤が蓋およびOリングと相互作用しないことを保証する。注: ここでは、すべての手順は無菌条件下で完了する必要があります。 解凍するクライオビシャルの数に対応する15 mL円錐遠心管の適切な数を準備します(ここでは、6 x 106 細胞/チューブ)。各チューブにプリウォームCCMのピペット9 mL。 ピペットは、クリオビシャルの内容物をCCMを含むチューブにゆっくりと(滴下)する。蓋を閉め、チューブごとに繰り返し、遠心分離機を200 x g で通常の遠心分離機の速度で5分間繰り返します。 ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。 血清学的ピペット(3 x 106 細胞/mLに対応する細胞密度)を使用して上下にピペット処理することにより、各チューブ(1つの凍結細胞からの細胞を含む)を2mLの前温めCCMで再懸濁します。 各チューブから、再懸濁した細胞を2つのウェル(ウェルあたり1mL)にピペット化し、以前に調製したCCMの2mLを含む6ウェルプレートの2つのウェル(1mL)を3 x 106 細胞/ウェル(1 x 106 細胞/mLの最終濃度に対応)の細胞密度に達する。他のすべてのチューブに対してこれを繰り返します。 セクション 1.5.3 で説明されているように、差別化を進めます。 6ウェルプレートを細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に2入れ、CCMをリフレッシュせずに6日間分化させます。 ヒト肺胞上皮組織の三重細胞共培養モデル 注:このセクションでは、12ウェルプレート挿入に対応するボリュームとセル番号について説明します。図 1 は、モデル アセンブリの計画タイムラインを要約したものです。 上皮細胞(A549細胞株)播種 サプライヤー(ATTC)が提供する勧告に従って上皮細胞を培養する。簡単に言えば、CCMの細胞を80%の細胞合流度(週に約2倍から3倍)で培養する。注:サブカルチャーA549は、5〜25の通路範囲でA549細胞を使用して、コカルチャーモデル組成の前に少なくとも4つの通路のための。 ピペット1.5mLの前温めCCMを12ウェルプレートに(ウェルの数は所望のモデル数に相当します)。 滅菌されたピンセットを使用して、個々の12ウェル細胞培養インサートを12ウェルプレートのウェルに入れる。 サブ栽培プロトコルに従ってフラスコから細胞を取り外す(すなわち、剥離剤を使用して、ステップ1.2.13で行われたように遠心分離によって薬剤を取り除く)。A549の最終的な細胞濃度に対応する適切な量のCCMで再中断する(ここでは、50 x 104 細胞/mL;挿入1回あたり0.5mLの細胞懸濁液、すなわち25 x 104 細胞/挿入、すなわち27.8 x 104 細胞/cm2の播種密度に相当する)。 1 mL ピペットを用いて挿入液の補助側に細胞懸濁液のピペット 0.5 mL(すなわち、25 x 104 細胞/挿入) を使用して挿入する。 蓋でプレートを覆い、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に42日間置きます。注:位相コントラスト顕微鏡でA549細胞の合流を定期的に確認してください。 MDDC シード処理 MDDCを含む6つのウェルプレートに未接続の細胞を有するCCMを吸引する。 各井戸に新鮮な温もりCCMの1 mLを追加します。 セルスクレーパーを使用し、各ウェルから付着したMDDCを取り外し(擦り付け)、既存の1mLのCCM 3xでウェルを静かに洗い、1つの円錐形遠心管に組み合わせます。 セルの懸濁液10 μLと10 μLのトリパンブルー溶液を使用したトリパンブルー排除法を使用して、セルカウンターを持つセルをカウントします。 ステップ1.2.13で行ったように細胞懸濁液を遠心分離する。 再中断に必要な CCM ボリュームを計算します (式 5)。<!– –>必要な MDDC 密度 = 42 x 104セル/mL;各インサートは、7 x 104セル/cm2のシードセル密度に対応する6.3 x 104セルを必要とします(ここでは、ステップ2.2.10で0.9 cm2に150 μLを加えました)。セル再懸濁液の CCM ボリューム (Vm;方程式5): そっと吸引し、挿入部にA549を成長させる12ウェルプレートの上部チャンバーからCCMを捨てます。 A549細胞を付けたインサートを、滅菌されたピンセットを使用して滅菌ペトリ皿の逆さまの位置に置きます。PBSで円錐形遠心管(50 mL)を準備し、セルスクレーパーをプレモイステンプします。 挿入物の基底面(すなわち、逆さまの位置の上の部分)からA549細胞を削り取り、挿入物の細孔を通して成長する必要があります。注:個々のサンプルを掻き取る間にPBS(チューブで準備)でスクレーパーをすすいで、手順全体を通して濡らしてください。 遠心分離(ステップ2.2.5)に際し、吸引し、上清を捨て、計算された量のCCM(ステップ2.2.6)とピペット3倍のピペットを再分散させる。 各インサートの上に細胞懸濁液のピペット150 μLは、挿入物の基底面全体が液体で均等に覆われ、気泡を含まないようにします。 蓋をして、70分間細胞培養インキュベーターに入れます。細胞培養プレート(インサートが最初に置かれている場所)からCCMを吸引し、バイオハザード液体廃棄物に廃棄し、各ウェルに新鮮なCCMのピペット1.5mLを入れ。蓋をしてプレートをセルインキュベーターに入れます(37°C、5%CO2)。2注:細胞の乾燥を避けるために、上記の期間を超えないでください。 インキュベーション後、各インサートを滅菌されたピンセットで慎重に保持し、CCMを含むプレートに通常の位置に置きます。蓋でプレートを覆い、細胞インキュベーター(37°C、5%CO2)に戻2します。 マクロファージ (MDM) シーディング 事前分化されたMDMを含む6つのウェルプレートを取り、細胞インキュベーターから層流フードに置きます。 6つのウェルプレートで成長した未接続のMDMでCCMを吸引し、各ウェルに新鮮な前温めたCCMのピペット1mLを捨てます。 セルスクレーパーを使用して、個々のウェルから付着したMDMを静かに取り除きます(MDDCのステップ2.2.3で行われているように)。 ピペット10 μLのトリパンブルーをウェルまたはチューブに入れ、MDMサスペンションの10 μLを加えて、1:1(v/v)の最終希釈を達成します。適切なカウント プロトコルを使用して、Mdm の数をカウントします。 ステップ1.2.13で行ったように細胞懸濁液を遠心分離する。 必要な体積を計算します(方程式6):必要な MDM 密度 = CCM の 2.5 x 104セル/mL (ここでは、各挿入には 0.5 mL CCM の 1.25 x 104 セルが必要です。4(6) 遠心分離の際、吸引し上清を捨て、計算された量のCCM(ステップ2.3.6)でMDMペレットを再分散し、ピペットを上下3倍にする。 1 mL ピペットを使用して A549 および MDDC (上皮細胞に直接ない) で挿入する細胞の壁に MDM 懸濁液の0.5 mL(ステップ2.3.7で調製)を慎重に。蓋をしたプレートをカバーし、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)を24時間置きます。2 共培養モデルを空気液体インタフェース(ALI)に移行 細胞培養インキュベーターで組み立てられたモデルの24時間(±2 h)のインキュベーション期間の終わりに、細胞培養インサートの補助的および基底部分の両方からCCMを吸引し、廃棄します。 滅菌されたピンセットを使用して、1 mLピペットを使用して各ウェルに新鮮な前温めたCCMの井戸とピペット0.6 mLから個々のインサートを持ち上げます。挿入の補助側に CCM を追加しないでください。 蓋をしたプレートをカバーし、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に24時間前に使用してください。2 3. 選択した陽性コントロールへの暴露(炎症促進反応を誘発するための既知の刺激) 注:共培養モデルを既知の炎症促進刺激因子内脂肪多糖(LPS)7および炎症性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)7に曝露してモデルの応答性を示す。7 7さらに、洗浄剤(Triton X-100)への暴露は、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイの感度を確認するために使用される。 正の対照溶液を準備する:LPSストック(蒸留水中の1mg /mL)、TNF-αストック(蒸留水中の100 μg/mL)およびトリトンX 100(PBSでは2%[v/v])。 ALI条件での共培養モデルの24時間の培養の際に、吸引し、基底コンパートメントから上清を捨てる。滅菌されたピンセットを使用して、各井戸に新鮮な前温化CCMの井戸とピペット0.6 mLから個々のインサートを持ち上げます。 CCMの在庫を円錐遠心管に希釈して、個々の正のコントロールの作業ソリューションを準備します: 1 μg/mL LPS、1 μg/mL TNF-α、および0.2%Triton-X 100。ボリュームは、テスト済み挿入数に対応しています(ここでは、100 μL/インサート)。3倍上下にピペットを入れるだけで、溶液をよく混ぜます。 細胞培養インサートの壁面にゆっくりとピペットを塗布することにより、各陽性対照溶液の100 μLを塗布します。ウェルプレートを蓋で覆い、細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に224時間置きます。インキュベーションの際、ピンセットを使用して個々のインサートを保持することにより、吸引し、挿入物の補助側で液体を捨てます。 基底コンパートメントにCCMを収集し、さらにLDH分析のために1)4°Cで保存し、細胞膜破裂媒介性細胞傷害性を示し、および/または2)-80°Cで保存して、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を介したタンパク質放出をさらに分析します。キットサプライヤーの推奨事項に従ってアッセイを実行します。 CCMを取り外した際に、挿入物をPBS 3xで洗浄し、細胞培養インサート上の細胞を4%[w/v]パラホルムアルデヒド(PBSでは室温で15分)に固定し、両方の挿入側がPFA溶液で十分に覆われていることを確認します。その後、3倍のPBSを洗浄してPFAを除去します。さらに免疫染色のためにPBSに沈んだサンプルを4°Cで保存する(この方法の一例は、前述17)。