Presentert her er en protokoll for å vurdere biventrikulær hjertefunksjon hos mus ved å generere trykk-volum (PV) sløyfer fra høyre og venstre ventrikkel i samme dyr ved hjelp av lukket brystkateterisering. Fokuset er på det tekniske aspektet ved kirurgi og datainnsamling.
Vurdering av hjertefunksjon er viktig for å utføre kardiovaskulær og pulmonal vaskulær preklinisk forskning. Trykk-volum-sløyfer (PV-sløyfer) generert ved registrering av både trykk og volum under hjertekateterisering er avgjørende når man vurderer både systolisk og diastolisk hjertefunksjon. Venstre og høyre hjertefunksjon er nært beslektet, reflektert i ventrikulær gjensidig avhengighet. Derfor er registrering av biventrikulær funksjon i samme dyr viktig for å få en fullstendig vurdering av hjertefunksjonen. I denne protokollen er en lukket brysttilnærming til hjertekateterisering i samsvar med måten kateterisering utføres hos pasienter vedtatt hos mus. Mens det er utfordrende, er den lukkede bryststrategien en mer fysiologisk tilnærming, fordi åpning av brystet resulterer i store endringer i forspenning og etterbelastning som skaper artefakter, særlig et fall i systemisk blodtrykk. Mens høyoppløselig ekkokardiografi brukes til å vurdere gnagere, er hjertekateterisering uvurderlig, spesielt når man vurderer diastolisk trykk i begge ventriklene.
Beskrevet her er en prosedyre for å utføre invasive, lukkede bryst, sekvensielle venstre og høyre ventrikulær trykkvolum (PV) sløyfer i samme dyr. PV-sløyfer er anskaffet ved hjelp av admittansteknologi med et musetrykk-volumkateter og trykk-volumsysteminnsamling. Prosedyren er beskrevet, som begynner med halsdisseksjonen, som er nødvendig for å få tilgang til høyre vena jugularis og høyre halspulsåre, til innsetting og posisjonering av kateteret, og til slutt datainnsamlingen. Deretter diskuteres kriteriene som kreves for å sikre oppkjøpet av PV-sløyfer av høy kvalitet. Til slutt beskrives analysen av venstre og høyre ventrikkels PV-sløyfer og de forskjellige hemodynamiske parametrene som er tilgjengelige for å kvantifisere systolisk og diastolisk ventrikkelfunksjon.
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) er hjertesykdom den ledende dødsårsaken over hele verden for både menn og kvinner 1,2,3. Mange studier fokuserer på å diagnostisere og forbedre nedsatt hjertefunksjon4. For disse applikasjonene er høy kvalitet og reproduserbar evaluering av hjertefunksjonen kritisk. High fidelity og reproduserbare kateterdata er nødvendig for å vurdere både etiologiske og terapeutiske responser. For eksempel er vurdering av hjertefunksjon viktig for å evaluere effekten av legemidler og annen behandling i prekliniske modeller av hjerteinfarkt5. Mens mange kardiovaskulære studier fokuserer på venstre ventrikkelfunksjon, er høyre ventrikkelfunksjon også en kritisk determinant for funksjonsevne og prognose hos pasienter med lungevaskulær sykdom 6,7. Hos pasienter med avansert hjertesvikt predikerer vedvarende forhøyet høyresidig og venstresidig fyllingstrykk den kombinerte risikoen for død, kardiovaskulær sykehusinnleggelse og hjertetransplantasjon8. Ved kombinert aorta- og mitralklaffsykdom er preoperativ myokardfunksjon (reflektert i parametere som hjerteindeks og venstre ventrikkels ejeksjonsfraksjon) den viktigste prediktoren for langtidsoverlevelse9. Høyre ventrikkelfunksjon er den viktigste prediktoren for både sykelighet og mortalitet ved pulmonal arteriell hypertensjon10,11. Dermed er vurdering av høyre ventrikkelfunksjon en nødvendig komponent i en omfattende preklinisk studie ved bruk av modeller av pulmonal arteriell hypertensjon12,13,14.
Venstre og høyre ventrikulær funksjon studeres ofte uavhengig. Men fordi funksjonene til venstre og høyre ventrikler er nært knyttet, er det ideelt å oppnå en biventrikulær vurdering av systolisk og diastolisk funksjon fra en enkelt test15. For eksempel deler høyre ventrikkel skrå fibre i interventrikkelseptum med venstre ventrikkel, som utgjør en av de mekaniske koblingene mellom venstre og høyre ventrikkelkontraktil funksjon16,17. Dette fenomenet, kjent som systolisk ventrikulær interaksjon, tillater venstre ventrikulær sammentrekning for å øke høyre ventrikulær sammentrekning. Ventrikulære interaksjoner under diastol er også viktige. Under diastolen påvirker volumet av en ventrikkel volumet av motsatt ventrikkel, og endrer dermed diastolisk etterlevelse og preload18,19. Ved patologiske forhold kan nedsatt funksjon av en ventrikkel, eller nedsatt volumbelastning, direkte eller indirekte svekke funksjonen til den andre ventrikkelen20. Som en konsekvens av systolisk ventrikkelinteraksjon kan en global reduksjon i venstre ventrikkelfunksjon redusere kontraktil ytelse i høyre ventrikkel15. Hos pasienter med hjertesvikt på grunn av systolisk funksjon i venstre ventrikkel og økt endediastolisk trykk er lungearterietrykket forhøyet, noe som indirekte øker etterbelastningen i høyre ventrikkel21,22. Omvendt utøver økt høyre ventrikkeltrykk og volumoverbelastning ved alvorlig pulmonal hypertensjon en mekanisk kompresjon på venstre hjerte. Denne D-formede flattningen av venstre ventrikkel, forårsaket av en venstreforskyvning i interventrikkelseptum, reduserer venstre ventrikkelvolum og nedsatt systolisk og diastolisk funksjon 23,24,25,26,27. Dermed er vurderingen av både venstre og høyre ventrikler avgjørende for å evaluere global hjertefunksjon i prekliniske modeller av menneskelig sykdom.
Hjertefunksjonen kan også vurderes ved ikke-invasiv ekkokardiografi, magnetisk resonanstomografi (MR) og invasiv kateterisering28,29,30. Ekkokardiografi er den mest brukte bildebehandlingsmodaliteten i kardiovaskulær forskning fordi den er relativt billig og tilgjengelig31. Ekkokardiografi har imidlertid flere tekniske begrensninger, blant annet indirekte måling av fylltrykk og begrenset evne til å kvantifisere diastolisk funksjon. I tillegg er kvaliteten på dataene oppnådd ved ekkokardiografi svært operatøravhengig. MR hjerte er et relativt nytt tilskudd til preklinisk bildearmamentarium som har stort potensial for kvantitativ vurdering av biventrikulær funksjon. Kvantifisering med hjerte-MR er nøyaktig, da den ikke gjør geometriske antagelser om ventrikkelform, i motsetning til ekkokardiografi32. Imidlertid er MR-bildebehandlingsplattformen dyr, og er sjelden tilgjengelig. Videre krever behandling av MR-data dyktig støtte fra en fysiker eller tilsvarende forsker, noe som mangler i mange prekliniske laboratorier33. Tilsvarende gir bruk av mikrocomputertomografi (MicroCT) i prekliniske studier kvantitative høyoppløselige tredimensjonale (3D) anatomiske data som kan oppnås ikke-invasivt, slik at longitudinelle studier34. Imidlertid krever MicroCT-avbildning injeksjon av kontrastmidler, som ofte er dyre. MicroCT-bildeplattformen, som MR, er også dyr og krever også en dyktig tekniker.
I motsetning til dette er kateterisering en invasiv teknikk som består av innføring av et kateter i høyre og / eller venstre ventrikkel for å måle trykk og / eller volum. Verktøyene som kreves for å utføre hjertekateterisering er ikke så dyre som ekkokardiografi, CT eller MR. Betydelig teknisk ferdighet for kateterisering og smådyr anestesi er nødvendig, imidlertid. Kateterisering muliggjør direkte og nøyaktige vurderinger av hjertefunksjon28. I denne protokollen brukes et PV-kateter for innleggelse for å vurdere hjertefunksjonen. Denne teknologien, basert på de forskjellige elektriske ledningsegenskapene til blod og hjertemuskel, muliggjør samtidig registrering av trykk og volum i hjertehulen og generering av PV-sløyfer i sanntid 5,35. Kort fortalt består kateteret av både eksitasjonselektroder og opptakselektroder. Eksitasjonselektrodene genererer et elektrisk felt inne i høyre eller venstre ventrikel. Den indre opptakselektroden måler spenningsendring, som er proporsjonal med en endring i motstand. Avledning av ventrikkelvolum er basert på Ohms lov (spenning = strøm x motstand) hvorfra konduktans (dvs. den inverse av motstand) beregnes. I denne innstillingen er den målte konduktansverdien en kombinasjon av blodkonduktans og muskelkonduktans. I det elektriske feltet er blodet rent resistivt mens muskel har både kapasitive og resistive egenskaper. Den kapasitive egenskapen til muskel forårsaker en tidsforsinkelse i det målte signalet. Sporing av denne forsinkelsen, kjent som “fase” -vinkelen, rapporterer hjertevevsinntrenging i feltet når hjertet trekker seg sammen. Denne målingen er størst ved systole og lavest ved diastol. Denne egenskapen tillater separasjon av muskelkomponenten av konduktansen fra blodet og tillater en nær tilnærming av absolutte systoliske og diastoliske volumer. Trykk-volumsløyfer gir en rekke hemodynamiske parametere som ikke er lett målbare ved andre metoder, for eksempel enkel retrograd kateterisering ved bruk av væskefylte katetre for å måle hjertetrykk. Trykk-volum-sløyfer måler ventrikkeltrykk, men gir også data om kontraktilitet, elastans, kraft, energi og effektivitet. I tillegg gir PV-sløyfer robuste kvantitative målinger36. Dermed har vurdering av hjertefunksjon av PV-sløyfer generert ved kateterisering dukket opp som gullstandarden i preklinisk forskning37. I tillegg er prekliniske teknikker relevante for menneskelig sykdom der hjertekateterisering, om enn med væskefylte katetre, er vanlig. Imidlertid krever hjertekateterisering hos gnagere upåklagelig anestesi og utmerket teknikk for å forhindre overdreven blodtap, hypoventilasjon eller endringer i kroppstemperatur.
Hos mennesker utføres hjertekateterisering i lukket brystkonfigurasjon, og vaskulær tilgang oppnås via vena jugularis eller subclavia for høyre ventrikkel og arteria radialis eller femoralis for venstre ventrikkel. På grunn av den lille størrelsen på mus er den lukkede brysttilnærmingen ofte utfordrende. Dermed vedtar studier utført på mus vanligvis en åpen brysttilnærming. Denne teknikken innebærer å åpne thorax, dermed eksponere hjertet, og lette innsetting av kateteret via punktering av venstre og / eller høyre ventrikkelapex 38. Selv om denne tilnærmingen er teknisk mindre utfordrende og ganske reproduserbar, inkluderer dens viktigste begrensninger blødning og andre komplikasjoner ved apikal innsetting av katetre, og et markert fall i intrakardial trykk som følge av å åpne brysthulen til atmosfærisk trykk. Åpning av thorax hos en ventilert gnager induserer en 5–10 mm Hg reduksjon i systolisk trykk i venstre ventrikkel og 2–5 mm Hg reduksjon i høyre ventrikkeltrykk39. Derfor ble det utviklet en lukket brysttilnærming som er mindre traumatisk for hjertet og gir mer fysiologisk relevante målinger som lettere kan oversettes til klinisk vurdering av hjertefunksjonen.
Vurdering av hjertefunksjon er et kritisk trinn for preklinisk kardiovaskulær og pulmonal vaskulær forskning. I dette arbeidet foreslo vi en protokoll for en lukket brystbiventrikulær vurdering av hjertefunksjon hos mus. Gjennom denne tilnærmingen kan man generere høyre ventrikkel og venstre ventrikkel PV-sløyfer i samme mus. Denne tilnærmingen gir en robust og fullstendig vurdering av hjertefunksjonen, som muliggjør måling av systolisk og diastolisk funksjon, samt slagvolum og hjerteutgang. I motsetning til den åpne brysttilnærmingen som klassisk brukes til kateterisering av gnagere, resulterer denne lukkede brystteknikken i mer stabil fysiologi og mer fysiologisk relevante data. Mens det er teknisk mer utfordrende og avhengig av operatørferdigheter for å kunne plassere kateteret i høyre og venstre ventrikkel, begrenser den lukkede brysttilnærmingen traumer og blødninger forbundet med åpen brystkirurgi og reduserer de drastiske trykkendringene forbundet med å utsette lungene for atmosfærisk trykk. Den lukkede brysttilnærmingen emulerer også bedre hjertekateteriseringsprosedyren som utføres hos pasienter, noe som forbedrer relevansen av å bruke denne teknikken i preklinisk forskning.
Den kirurgiske prosedyren er det kritiske trinnet i protokollen. Selv når du bruker et kirurgisk mikroskop for kateterinnsetting i halsvenen eller halspulsåren, som anbefales, krever denne prosedyren praksis og teknisk dyktighet. Forsiktig disseksjon av karene fri fra omkringliggende fascia ved hjelp av mild, stump disseksjon vil øke suksessen med kanylering samtidig som risikoen for blødning minimeres. For å minimere blodtap er det avgjørende å kanylere karoten i sekvensielle trinn: 1) introdusere kateterspissen i halspulsåren; 2) Bind suturen forsiktig rundt den delen av arterien som inneholder kateteret; 3) slipp den sikre suturen, slik at kateterbevegelsen opprettholdes samtidig som du opprettholder forsiktig oppadgående trekkraft for å minimere blødning; og 4) flytte kateteret til aorta. Plassering av kateteret i ventrikkelen, som bestemmes av sanntids bølgeformovervåking, er den mest utfordrende delen av denne protokollen. Alle kateterets elektroder skal være innenfor ventrikkelhulen, og ingen skal berøre veggen. Enhver feil plassering av kateteret vil resultere i uregelmessige PV-sløyfer og vil påvirke eller utelukke datainnsamling negativt. Ved å gjenkjenne den karakteristiske trykk-volum-bølgeformen som følger av å ha alle elektroder i ventrikkelen, kan man være trygg på en passende kateterposisjon. Det er kritisk å oppnå en stabil ventrikkeltrykkbølgeform og stabile trykkstørrelsesløkker før du skifter til PV-modus og voluminnsamling. Riktig kunnskap om hjertefysiologi og anatomi er avgjørende for å lykkes med denne prosedyren. Online lesing av PV-sporene, fra atriumet, trikuspidalventilområdet og høyre ventrikkel, vil vise fremdriften av kateteret og bidra til å oppnå riktig posisjonering. Det er viktig å kjenne den normale hjertefrekvensen (400–600 bpm), og bølgeformer og trykk som forventes (f.eks. systolisk trykk i høyre ventrikkel, 18–25 mm Hg, diastolisk trykk <5 mm Hg; systolisk trykk i venstre ventrikkel 60–120 mm Hg40, diastolisk trykk <8 mmHg) hos mus for å tillate operatøren å evaluere sannheten til de observerte dataene.
Kvaliteten og reproduserbarheten av dataene vil avhenge av prosedyrens hastighet og blodtap eller blødning. Prosedyren fra anestesi til ferdigstillelse av datainnsamling tar i gjennomsnitt ~ 30-40 min / mus. Høyre hjertekateterisering fra innsetting av kateter til datainnsamling tar 5–10 min, venstre hjertekateterisering fra innsetting av kateter til datainnsamling tar ytterligere 10–15 min. Data om publiseringskvalitet oppnås i ~ 75% av tilfellene. Sekvensen av trinn i hjertekateteriseringen bør holdes konstant mellom dyrene. I denne prosedyren intuberes musene først, etterfulgt av høyre ventrikulær kateterisering, og til slutt venstre ventrikulær kateterisering. Beslutningen om å fortsette i denne rekkefølgen er basert på større vanskeligheter og blødningsrisiko for venstre hjerte versus høyre hjertekateterisering. En ikke-spesifikk 50 Hz støyopptaksartefakt kan observeres. Denne støyen kan reduseres ved hjelp av et FIR filter med høy cutoff ved 50 Hz og en lav cutoff på 0 på programvaren. For volumkanalen oppretter du et nytt kanal-/filter-/FIR-filter. Et hakkfilter på 50 Hz kan også brukes under datainnsamling for å eliminere nettstøy og fjerne radiofrekvensforstyrrelser.
Jo raskere kateteriseringen gjøres, desto bedre er kvaliteten på dataene. Basert på tidligere erfaring anbefales det å innhente dataene innen 15 min. Økt kateteriseringstid øker det fysiologiske stresset på dyret og øker risikoen for arytmi på grunn av tilstedeværelsen av kateteret i hulrommet. Disse kreftene kan redusere slagvolumet og svekke reproduserbarheten og tolkbarheten til bølgeformene. I tillegg er spissen av kateteret skarp og kan skade eller punktere ventrikkelen. Dette er spesielt viktig for høyre ventrikkel, som er ~ 1/3rd tykkelsen på venstre ventrikkel.
Invasiv trakeostomi og mekanisk ventilasjon med positivt trykk resulterer i stabil og kontrollert pusting av musene og reduserer variasjonen i PV-sløyfeoppkjøpet. Imidlertid er positivt endeekspiratorisk trykk (PEEP) en markert kontrast til normal ventilasjon, som er et negativt trykkfenomen. Sammen reduserer overtrykksventilasjon og PEEP hjertets minuttvolum og reduserer høyre hjertetrykk. Selv om det kreves for innsamling av stabile data, vil mekanisk ventilasjon samt kardiodepressive effekter av anestesien påvirke PV-sløyfene og bør betraktes som en begrensning. Forbigående stopp av mekanisk ventilasjon under kort registrering av PV-sløyfer brukes til å eliminere denne potensielle kilden til artefakter. Merk at ventilasjonseffektiviteten kan bekreftes ved kapnografiovervåking av karbondioksid.
De tekniske ferdighetene som kreves for lukket bryst tilnærming kan være en begrensning av denne teknikken. Likeledes er det utfordrende å oppnå riktig, stabil posisjonering av kateteret i ventrikkelen. Oddsen for suksess øker med operatørerfaring og med musens størrelse og vekt. Kateterisering av mus under 20 g er ekstremt utfordrende. Den unike kammergeometrien til høyre ventrikkel kan påvirke volummåling og bør vurderes. Bedøvelsen som brukes, hjertefrekvens, temperaturer og dyrebelastning kan påvirke hemodynamiske parametere og bør rapporteres nøye og overvåkes.
Avslutningsvis utføres både høyre og venstre ventrikulær kateterisering i samme mus i denne protokollen. Avhengig av forskerens spesifikke mål, kan venstre eller høyre ventrikulær kateterisering utføres uavhengig, ved hjelp av den relevante delen av biventrikulær prosedyre. Tilnærmingen som presenteres er imidlertid optimal for fullstendig vurdering av hjertefunksjonen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne hjelp og samarbeid med Queen’s University dyreavdeling personlig. Forfatterne ønsker å anerkjenne hjelp fra Austin Read, TMED MSc kandidat.
Denne studien ble støttet delvis av US National Institutes of Health (NIH) tilskudd NIH 1R01HL113003-01A1 (SLA), NIH 2R01HL071115-06A1 (SLA), Canada Foundation for Innovation og Queen’s Cardiopulmonary Unit (QCPU) 229252 og 33012 (SLA), Tier 1 Canada Research Chair i mitokondriell dynamikk og translasjonsmedisin 950-229252 (SLA), Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Foundation Grant CIHR FDN 143261, William J. Henderson Foundation (SLA), Canadian Vascular Network Scholar Award (FP), og Paroian Family-stipendet fra pulmonal hypertension association of Canada (FP)
ADVantage Pressure-Volume System (ADV500) | Transonic | FY097B | |
Endozime AW triple plus | Ruhof | 34521 | |
Fiber optic dual Gooseneck | Volpi Intralux | # 6000-1 | |
Forceps | F.S.T | 11052-10 | |
Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441400 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13003-10 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13018-14 | |
Heparin sodium | Sandoz | 023-3086 | 100 U/L |
High-fidelity admittance catheter | Scisence; Transonic | FTH-1212B-3518 | |
Isofluorane | Baxter | CA2L9108 | |
labScribe v4 software | iworx | LS-30PVL | |
Needle (30 gauge) | BD | 305106 | |
sodium chloride injection | Baxter | JB1309M | 0.9%(wt/vol) |
Stereo microscope | Cole-Parmer | OF-48920-10 | |
Surgical suture | SERAFLEX | ID158000 | black braided silk, 4.0 |
Surgical tape | 3M, Transpore | SN770 | |
Tabletop Single Animal Anesthesia Systems | Harvard apparatus | 72-6468 | |
Tracheotomy canula 1.45 mm diameter | Harvard apparatus | 72-1410 | |
Ventilator, far infrared warming pad for mice and rats PhysioSuite | Kent scientific corporation | # PS-02 |