Præsenteret her er en protokol til vurdering af biventrikulær hjertefunktion hos mus ved at generere trykvolumensløjfer (PV) fra højre og venstre ventrikel i samme dyr ved hjælp af lukket brystkateterisering. Fokus er på det tekniske aspekt af kirurgi og dataindsamling.
Vurdering af hjertefunktion er afgørende for at udføre kardiovaskulær og lunge-vaskulær præklinisk forskning. Trykvolumensløjfer (PV-sløjfer) genereret ved registrering af både tryk og volumen under hjertekateterisering er afgørende ved vurdering af både systolisk og diastolisk hjertefunktion. Venstre og højre hjertefunktion er nært beslægtede, hvilket afspejles i ventrikulær indbyrdes afhængighed. Således er registrering af biventrikulær funktion i samme dyr vigtig for at få en fuldstændig vurdering af hjertefunktionen. I denne protokol er en lukket brysttilgang til hjertekateterisering i overensstemmelse med den måde, kateterisering udføres hos patienter, vedtaget hos mus. Selvom det er udfordrende, er den lukkede bryststrategi en mere fysiologisk tilgang, fordi åbning af brystet resulterer i store ændringer i forbelastning og efterbelastning, der skaber artefakter, især et fald i systemisk blodtryk. Mens ekkokardiografi med høj opløsning bruges til at vurdere gnavere, er hjertekateterisering uvurderlig, især ved vurdering af diastolisk tryk i begge ventrikler.
Beskrevet her er en procedure til at udføre invasive, lukkede bryst-, sekventielle venstre og højre ventrikulære trykvolumen (PV) sløjfer i samme dyr. PV-sløjfer erhverves ved hjælp af adgangsteknologi med et musetryk-volumenkateter og trykvolumensystemerhvervelse. Proceduren er beskrevet, begyndende med halsdissektionen, som er nødvendig for at få adgang til højre jugularvene og højre halspulsåre, til indsættelse og placering af kateteret og endelig dataindsamlingen. Derefter diskuteres de kriterier, der kræves for at sikre erhvervelse af PV-sløjfer af høj kvalitet. Endelig beskrives analysen af venstre og højre ventrikulære PV-sløjfer og de forskellige hæmodynamiske parametre, der er tilgængelige til kvantificering af systolisk og diastolisk ventrikulær funktion.
Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er hjertesygdomme den største dødsårsag på verdensplan for både mænd og kvinder 1,2,3. Mange undersøgelser fokuserer på diagnosticering og forbedring af nedsat hjertefunktion4. For disse applikationer er høj kvalitet og reproducerbar evaluering af hjertefunktionen kritisk. High fidelity og reproducerbare kateterdata er nødvendige for at vurdere både etiologisk og terapeutisk respons. For eksempel er vurderingen af hjertefunktionen afgørende for at evaluere effektiviteten af lægemidler og andre behandlinger i prækliniske modeller af myokardieinfarkt5. Mens mange kardiovaskulære undersøgelser fokuserer på venstre ventrikelfunktion, er højre ventrikelfunktion også en kritisk determinant for funktionel kapacitet og prognose hos patienter med lunge-vaskulær sygdom 6,7. Hos patienter med fremskreden hjerteinsufficiens er vedvarende forhøjede højresidige og venstresidede påfyldningstryk prædiktive for den kombinerede risiko for død, kardiovaskulær hospitalsindlæggelse og hjertetransplantation8. I kombineret aorta- og mitralklapsygdom er præoperativ myokardiefunktion (afspejlet i parametre som hjerteindeks og venstre ventrikulær udstødningsfraktion) den vigtigste forudsigelse for langsigtet overlevelse9. Højre ventrikelfunktion er den vigtigste prædiktor for både sygelighed og dødelighed ved pulmonal arteriel hypertension10,11. Vurdering af højre ventrikelfunktion er således en nødvendig komponent i et omfattende præklinisk studie ved hjælp af modeller for pulmonal arteriel hypertension12,13,14.
Venstre og højre ventrikulær funktion studeres ofte uafhængigt. Men fordi funktionerne i venstre og højre ventrikler er tæt forbundet, er det ideelt at opnå en biventrikulær vurdering af systolisk og diastolisk funktion fra en enkelt test15. For eksempel deler højre ventrikel skrå fibre i det interventrikulære septum med venstre ventrikel, som udgør en af de mekaniske forbindelser mellem venstre og højre ventrikulær kontraktil funktion16,17. Dette fænomen, kendt som systolisk ventrikulær interaktion, tillader venstre ventrikulær sammentrækning at øge højre ventrikulær sammentrækning. Ventrikulære interaktioner under diastol er også vigtige. Under diastol påvirker volumenet af en ventrikel volumenet af den modsatte ventrikel og ændrer derved diastolisk overholdelse og forspænding18,19. Under patologiske tilstande kan nedsat funktion af en ventrikel eller nedsat volumenbelastning direkte eller indirekte forringe funktionen af den anden ventrikel20. Som følge af systolisk ventrikulær interaktion kan et globalt fald i venstre ventrikelfunktion reducere højre ventrikels kontraktile ydeevne15. Hos patienter med hjertesvigt på grund af systolisk funktion i venstre ventrikel og øget diastolisk tryk i slutningen er lungearterietrykket forhøjet, hvilket indirekte øger efterbelastningen af højre ventrikel21,22. Omvendt udøver øget højre ventrikulært tryk og volumenoverbelastning ved svær pulmonal hypertension en mekanisk kompression på venstre hjerte. Denne D-formede udfladning af venstre ventrikel, forårsaget af et venstreskift i det interventrikulære septum, reducerer venstre ventrikulære volumener og nedsat systolisk og diastolisk funktion 23,24,25,26,27. Således er vurderingen af både venstre og højre ventrikel afgørende for at evaluere global hjertefunktion i prækliniske modeller af menneskelig sygdom.
Hjertefunktion kan også vurderes ved ikke-invasiv ekkokardiografi, magnetisk resonansbilleddannelse (MR) og invasiv kateterisering28,29,30. Ekkokardiografi er den mest almindeligt anvendte billeddannelsesmodalitet i kardiovaskulær forskning, fordi den er relativt billig og tilgængelig31. Ekkokardiografi har imidlertid flere tekniske begrænsninger, herunder indirekte måling af påfyldningstryk og begrænset evne til at kvantificere diastolisk funktion. Derudover er kvaliteten af de data, der opnås ved ekkokardiografi, stærkt operatørafhængig. Hjerte-MR er en relativt ny tilføjelse til præklinisk billeddannelsesvåbenarium, der har stort potentiale for kvantitativ vurdering af biventrikulær funktion. Kvantificering med hjerte-MR er nøjagtig, da den ikke gør geometriske antagelser om ventrikulær form, i modsætning til ekkokardiografi32. MR-billedplatformen er imidlertid dyr og er sjældent tilgængelig. Desuden kræver behandlingen af MR-data kvalificeret støtte fra en fysiker eller tilsvarende videnskabsmand, hvilket mangler i mange prækliniske laboratorier33. Tilsvarende giver brugen af mikrocomputertomografi (MicroCT) i prækliniske undersøgelser kvantitative tredimensionelle (3D) anatomiske data med høj opløsning, der kan opnås ikke-invasivt, hvilket muliggør langsgående undersøgelser34. Imidlertid kræver MicroCT-billeddannelse injektion af kontrastmidler, som ofte er dyre. MicroCT-billeddannelsesplatformen er ligesom MR også dyr og kræver også en dygtig tekniker.
I modsætning hertil er kateterisering en invasiv teknik, der består af indførelsen af et kateter i højre og / eller venstre ventrikel for at måle tryk og / eller volumen. De nødvendige værktøjer til at udføre hjertekateterisering er ikke så dyre som ekkokardiografi, CT eller MR. Der kræves dog betydelige tekniske færdigheder til kateterisering og bedøvelse af små dyr. Kateterisering muliggør direkte og nøjagtige vurderinger af hjertefunktionen28. I denne protokol anvendes et PV-kateter til at vurdere hjertefunktionen. Denne teknologi, der er baseret på de forskellige elektriske ledningsegenskaber for blod og hjertemuskel, muliggør samtidig registrering af tryk og volumen i hjertehulen og generering af PV-sløjfer i realtid 5,35. Kort fortalt består kateteret af både excitationselektroder og optageelektroder. Excitationselektroderne genererer et elektrisk felt inde i højre eller venstre ventrikel. Den indre optageelektrode måler spændingsændring, som er proportional med en ændring i modstand. Afledt ventrikulært volumen er baseret på Ohms lov (spænding = strøm x modstand), hvorfra konduktans (dvs. den inverse modstand) beregnes. I denne indstilling er den målte konduktansværdi en kombination af blodkonduktans og muskelkonduktans. På det elektriske område er blod rent resistivt, mens muskler har både kapacitive og resistive egenskaber. Den kapacitive egenskab af muskel forårsager en tidsforsinkelse i det målte signal. Sporing af denne forsinkelse, kendt som “fase” -vinklen, rapporterer hjertevævsindtrængning i marken, når hjertet trækker sig sammen. Denne måling er størst ved systole og lavest ved diastol. Denne egenskab tillader adskillelse af muskelkomponenten i konduktansen fra blodets og tillader en tæt tilnærmelse af absolutte systoliske og diastoliske volumener. Trykvolumensløjfer giver en række hæmodynamiske parametre, der ikke let kan måles ved andre metoder, såsom simpel retrograd kateterisering ved hjælp af væskefyldte katetre til måling af hjertetryk. Trykvolumensløjfer måler ventrikulære tryk, men giver også data om kontraktilitet, elastans, effekt, energi og effektivitet. Derudover giver solcellesløjfer robuste kvantitative målinger36. Således har vurdering af hjertefunktion ved PV-sløjfer genereret ved kateterisering vist sig som guldstandarden i præklinisk forskning37. Derudover er prækliniske teknikker relevante for sygdom hos mennesker, hvor hjertekateterisering, omend med væskefyldte katetre, er almindelig. Imidlertid kræver hjertekateterisering hos gnavere upåklagelig anæstesi og fremragende teknik for at forhindre overdreven blodtab, hypoventilation eller ændringer i kropstemperaturen.
Hos humane patienter udføres hjertekateterisering i lukket brystkonfiguration, og vaskulær adgang opnås via jugular eller subclavian vene for højre ventrikel og den radiale eller lårbensarterie for venstre ventrikel. På grund af musens lille størrelse er den lukkede brysttilgang ofte udfordrende. Således anvender undersøgelser udført på mus almindeligvis en åben brysttilgang. Denne teknik indebærer åbning af thorax, hvorved hjertet blotlægges, og lette indsættelsen af kateteret via punktering af venstre og / eller højre ventrikulær apex38. Mens denne tilgang er teknisk mindre udfordrende og ret reproducerbar, omfatter dens største begrænsninger blødning og andre komplikationer ved apikal indsættelse af katetre og et markant fald i intrakardielt tryk som følge af åbning af brysthulen til atmosfærisk tryk. Åbning af thoraxen i en ventileret gnaver inducerer et 5-10 mm Hg fald i venstre ventrikulært systolisk tryk og 2-5 mm Hg fald i højre ventrikulært tryk39. Derfor blev der udviklet en lukket brysttilgang, der er mindre traumatisk for hjertet og giver mere fysiologisk relevante målinger, der lettere oversættes til klinisk vurdering af hjertefunktionen.
Vurdering af hjertefunktion er et kritisk skridt for præklinisk kardiovaskulær og lunge-vaskulær forskning. I dette arbejde foreslog vi en protokol for en lukket bryst biventrikulær vurdering af hjertefunktionen hos mus. Gennem denne tilgang kan man generere højre ventrikel og venstre ventrikel PV-sløjfer i samme mus. Denne tilgang giver en robust og komplet vurdering af hjertefunktionen, hvilket muliggør måling af systolisk og diastolisk funktion samt slagvolumen og hjerteudgang. I modsætning til den åbne brysttilgang, der klassisk anvendes til gnaverkateterisering, resulterer denne lukkede brystteknik i mere stabil fysiologi og mere fysiologisk relevante data. Mens teknisk mere udfordrende og afhængig af operatørens færdigheder for at kunne placere kateteret i højre og venstre ventrikel, begrænser den lukkede brysttilgang traumet og blødningen forbundet med åben brystkirurgi og reducerer de drastiske trykændringer forbundet med at udsætte lungerne for atmosfærisk tryk. Den lukkede brysttilgang efterligner også bedre hjertekateteriseringsproceduren udført hos patienter, hvilket øger relevansen af at anvende denne teknik i præklinisk forskning.
Den kirurgiske procedure er det kritiske trin i protokollen. Selv når du bruger et kirurgisk mikroskop til kateterindsættelse i jugularvenen eller halspulsåren, hvilket anbefales, kræver denne procedure øvelse og teknisk dygtighed. Omhyggelig dissektion af karrene fri for omgivende fascia ved hjælp af blid, stump dissektion vil øge kanyleringens succes og samtidig minimere risikoen for blødning. For at minimere blodtab er det afgørende at kannulere carotis i sekventielle trin: 1) indføre kateterspidsen i halspulsåren; 2) bind forsigtigt suturen omkring den del af arterien, der indeholder kateteret; 3) frigør den sikre sutur, hvilket tillader kateterbevægelse, samtidig med at der opretholdes blid opadgående trækkraft for at minimere blødning; og 4) fremfør kateteret til aorta. Placering af kateteret i ventriklen, som bestemt ved realtidsbølgeformovervågning, er den mest udfordrende del af denne protokol. Alle kateterets elektroder skal være inden for ventrikelhulen, og ingen bør røre væggen. Enhver forkert placering af kateteret vil resultere i uregelmæssige PV-sløjfer og vil påvirke eller udelukke dataindsamling negativt. At genkende den karakteristiske trykvolumenbølgeform, der skyldes at have alle elektroder i ventriklen, gør det muligt for en at være sikker på en passende kateterposition. Det er afgørende at opnå en stabil ventrikulær trykbølgeform og stabile trykstørrelsessløjfer, før der skiftes til PV-tilstand og volumenoptagelse. Korrekt kendskab til hjertefysiologi og anatomi er afgørende for succesen med denne procedure. Online aflæsning af PV-sporene fra atriummet, tricuspidventilområdet og højre ventrikel viser kateterets fremrykning og hjælper med at opnå korrekt positionering. Det er afgørende at kende den normale puls (400-600 bpm) og forventede bølgeformer og tryk (f.eks. Systolisk tryk i højre ventrikel, 18-25 mm Hg, diastolisk tryk <5 mm Hg; systolisk tryk i venstre ventrikel 60-120 mm Hg40, diastolisk tryk <8 mmHg) hos mus for at give operatøren mulighed for at evaluere rigtigheden af de observerede data.
Kvaliteten og reproducerbarheden af dataene afhænger af procedurens hastighed og blodtab eller blødning. Proceduren fra anæstesi til afslutning af dataindsamling tager i gennemsnit ~ 30-40 min / mus. Højre hjertekateterisering fra indsættelse af kateteret til dataindsamling tager 5-10 minutter, venstre hjertekateterisering fra indsættelsen af kateteret til dataindsamlingen tager yderligere 10-15 minutter. Data af publikationskvalitet opnås i ~75% af tilfældene. Sekvensen af trin i hjertekateteriseringen skal holdes konstant mellem dyrene. I denne procedure intuberes musene først, efterfulgt af højre ventrikulær kateterisering og endelig venstre ventrikulær kateterisering. Beslutningen om at fortsætte i denne rækkefølge er baseret på den større vanskelighed og blødningsrisiko ved venstre hjerte versus højre hjertekateterisering. En uspecifik 50 Hz støjoptagelsesartefakt kan observeres. Denne støj kunne mindskes ved hjælp af et FIR-filter med en høj cutoff ved 50 Hz og en lav cutoff på 0 på softwaren. Opret et nyt kanal/filter/FIR-filter til volumenkanalen. Et hakfilter på 50 Hz kan også anvendes under dataindsamling for at eliminere netstøj og fjerne enhver radiofrekvensinterferens.
Jo hurtigere kateteriseringen udføres, desto bedre er kvaliteten af dataene. Baseret på tidligere erfaringer anbefales det at indhente dataene inden for 15 min. Øget kateteriseringstid øger den fysiologiske stress på dyret og øger risikoen for arytmi på grund af kateterets tilstedeværelse i hulrummet. Disse kræfter kan reducere slagvolumen og forringe bølgeformernes reproducerbarhed og fortolkningsevne. Derudover er spidsen af kateteret skarp og kan beskadige eller punktere ventriklen. Dette er især vigtigt for højre ventrikel, som er ~ 1/3rd tykkelsen af venstre ventrikel.
Invasiv trakeostomi og mekanisk ventilation med positivt tryk resulterer i stabil og kontrolleret vejrtrækning af musene og mindsker variationen i erhvervelsen af PV-sløjfer. Imidlertid er positivt slutekspiratorisk tryk (PEEP) en markant kontrast til normal ventilation, som er et undertryksfænomen. Sammen sænker ventilation med positivt tryk og PEEP hjerteudgangen og reducerer det rigtige hjertetryk. Selvom det kræves for erhvervelse af stabile data, vil mekanisk ventilation såvel som kardiodepressive virkninger af anæstesien påvirke PV-sløjferne og bør betragtes som en begrænsning. Forbigående standsning af mekanisk ventilation under den korte optagelse af PV-sløjfer bruges til at eliminere denne potentielle kilde til artefakter. Bemærk, at ventilationseffektiviteten kan bekræftes ved kapnografiovervågning af kuldioxid.
De tekniske færdigheder, der kræves til den lukkede brysttilgang, kan være en begrænsning af denne teknik. Ligeledes er det udfordrende at opnå korrekt, stabil positionering af kateteret i ventriklen. Oddsene for succes stiger med operatørens erfaring og med musenes størrelse og vægt. Kateterisering af mus under 20 g er ekstremt udfordrende. Den unikke kammergeometri i højre ventrikel kan påvirke volumenmålingen og bør overvejes. Det anvendte bedøvelsesmiddel, hjertefrekvenser, temperaturer og dyrestamme kan påvirke de hæmodynamiske parametre og bør rapporteres og overvåges nøje.
Afslutningsvis udføres både højre og venstre ventrikulær kateterisering i samme mus i denne protokol. Afhængigt af en videnskabsmands specifikke mål kan venstre eller højre ventrikulær kateterisering udføres uafhængigt ved anvendelse af den relevante del af den biventrikulære procedure. Den præsenterede tilgang er imidlertid optimal til fuldstændig vurdering af hjertefunktionen.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende hjælpen og samarbejdet med Queen’s University dyrefacilitet personlig. Forfatterne vil gerne anerkende hjælpen fra Austin Read, TMED MSc-kandidat.
Denne undersøgelse blev delvist støttet af US National Institutes of Health (NIH) tilskud NIH 1R01HL113003-01A1 (SLA), NIH 2R01HL071115-06A1 (SLA), Canada Foundation for Innovation og Queen’s Cardiopulmonary Unit (QCPU) 229252 og 33012 (SLA), Tier 1 Canada Research Chair i mitokondriel dynamik og translationel medicin 950-229252 (SLA), Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Foundation Grant CIHR FDN 143261, William J. Henderson Foundation (SLA), Canadian Vascular Network Scholar Award (FP) og Paroian Family scholarship fra pulmonal hypertension association of Canada (FP)
ADVantage Pressure-Volume System (ADV500) | Transonic | FY097B | |
Endozime AW triple plus | Ruhof | 34521 | |
Fiber optic dual Gooseneck | Volpi Intralux | # 6000-1 | |
Forceps | F.S.T | 11052-10 | |
Forceps | F.S.T | 11251-20 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441400 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13003-10 | |
Hemostatic clamp | F.S.T | 13018-14 | |
Heparin sodium | Sandoz | 023-3086 | 100 U/L |
High-fidelity admittance catheter | Scisence; Transonic | FTH-1212B-3518 | |
Isofluorane | Baxter | CA2L9108 | |
labScribe v4 software | iworx | LS-30PVL | |
Needle (30 gauge) | BD | 305106 | |
sodium chloride injection | Baxter | JB1309M | 0.9%(wt/vol) |
Stereo microscope | Cole-Parmer | OF-48920-10 | |
Surgical suture | SERAFLEX | ID158000 | black braided silk, 4.0 |
Surgical tape | 3M, Transpore | SN770 | |
Tabletop Single Animal Anesthesia Systems | Harvard apparatus | 72-6468 | |
Tracheotomy canula 1.45 mm diameter | Harvard apparatus | 72-1410 | |
Ventilator, far infrared warming pad for mice and rats PhysioSuite | Kent scientific corporation | # PS-02 |