初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

すべての研究および動物ケア手順は、ベイラー医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認され、ベイラー医科大学の実験動物ケア承認動物施設の評価と認定協会に収容されました。すべての株はC57BL6の背景に維持された。 1. 胚解剖(E7.5-E9.5) 妊娠中の雌マウスから子宮の角を取り除き、切開が行われる70%エタノールで腹部を殺菌する。 リン酸緩衝生理食塩分(PBS)ですすいで子宮をきれいにしてください。子宮を無菌のプラスチック10cm皿に入れます。 マイクロディションはさみを使用して、領域を含む各デシドゥアを互いに分離する。子宮筋を剥がし、すべてのデシドゥアを露出させる。各胚からデシドゥアを1つずつ取り除きます。 各胚から黄身嚢を取り除き、ジェノタイピングのために保存します。 すべての胚をイメージング用の新鮮なPBSの新しい皿に移動します。 ごみ全体の画像を撮る。各胚を個別に画像化し、各胚のスマイト数をカウントする。実験の間に倍率と露出(蛍光の場合)を同じに保ちます。注: 50~200 ms の曝露は蛍光に適しており、明視野設定には 20 ms が適していることがわかります。 2. 胚解離と細胞の並べ替え 各胚のソート元に対して、以下の手順を実行します。 E8.0より古い胚のオティックプラコードのすぐ上の首を切る(頭蓋領域の標識された細胞だけが望まれる場合)。E7.5胚の場合、胚外構造を除去する(適切な胚だけが望まれる場合)。 PBSの最小量で頭を48ウェルプレートのきれいな井戸に移動します。パパイン(27 U/mL)を250μL加えます。ピペットはp200を使用して穏やかに上下に。 顕微鏡の下で確認し、塊と単一細胞を探します。 単一の細胞懸濁液が達成されるまで、穏やかなピペットを上下に繰り返します(通常、E7.5-E9.5の場合は30〜1分の間に相当する3ラウンドのピペットアップとダウン)。 牛胎児血清(FBS)の250 μLでクエンチ。 ソートする各胚について、ステップ 2.1.1~2.1.5 を繰り返します。 35 μmナイロンメッシュフィルターキャップチューブを通して500 μLのセルサスペンションをフィルターし、塊を取り除きます。 濾液を取り、新しい1.5 mLチューブに移動し、5分間200 x g で回転します。上清を注意深く取り除き、新しいチューブに移します(生細胞がペレットに入ると分かるまで保存してください)。 0.5〜1%のウシ血清アルブミンを含むPBSの300 μLで細胞ペレットを再懸濁し、ソートするまで氷の上に保ちます(今から選別の終わりまでの時間を最小限に抑えます)。 必要に応じて、セル懸濁液を10 μLとし、10 μLのトリパンブルー(0.4%)と組み合わせます。そして、トリパンブルーが死んだ細胞のみを染色するように、おおよその細胞定量と生存率を識別するために血球計を使用してカウントします。 並べ替える直前に、フィルター キャップ チューブを通して各サンプルを再度フィルターし、ライブ セルの DAPI 染色を追加します。 70 μmノズルを備えた細胞選別機で、各サンプルを500 μLのRNA抽出溶解溶液( 材料表を参照)に並べ替えます。 すべてのサンプルが収穫されるまで-80 °Cで混合して保存します。この時点から進むのは、実験に必要なすべてのサンプルが収集され、ライブラリ準備のラウンド間の技術的なばらつきが減少した場合のみです。 3. RNA抽出 注: プロトコルは RNA 分離キットから調整されます。「材料表」を参照してください。 各サンプルに500 μLのRNA抽出溶解溶液( 材料表を参照)を加えると、合計体積は1000 μLになります。 各サンプルを室温で解凍します。 各サンプルを1.5分間渦し、均質化を開始する前にキャップが各チューブにしっかりと固定されていることを確認します。室温(15~25°C)で5分間、ホモジュネートをインキュベートします。 クロロホルムを140μL、キャップチューブをしっかりと加え、15秒の間激しく振ります。室温で3分間インキュベートします。 遠心分離機 15分 12,000 x g で 4 °C. 上部水相を氷上の新しいコレクションチューブに移します。相間または有機相を移さない。ピンクの有機相に近づくとき、チューブを左右に傾け、明確な水相が採取できないまで小さなアリコートを取り除きます。 次のステップで正しい計算をするために各サンプルから採取した水相を含むRNAの体積を測定します。 100%エタノールの1.5ボリューム(通常は525μLですが、わずかに多くまたは少ない場合があります)を加え、ピペットで十分に混ぜます。 2 mL採取チューブのカラムに、任意の沈殿物を含む最大700 μLのサンプルをピペット。蓋と遠心分離機を室温で 15s の≥8,000 x gで閉じます。フロースルーを破棄します。 残りのサンプルを使用して、ステップ 3.8 を繰り返します。 製造元の指示に従ってカラムを洗います。全速で1分間回転させて柱を乾かします。カラムを新しい1.5 mLコレクションチューブに移します。 ピペット11μLのヌクレアーゼフリー水を膜の中心に取り付けます。室温で1分間座ります。カラムを外すために1分間の最大速度を回転させます。 分光光度計と平行キャピラリー電気泳動装置を用いてRNA濃度を測定する(材料表)。 4. 図書館の準備 注:プロトコルは、小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックから適応されています。 「 材料表」を参照してください。 3’アダプターの1/4希釈を使用した小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、変性と3’アダプタライゲーションを完了します。 超過3’アダプタの取り外しを続けます。 小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、アダプターの枯渇を完了します。ビードのクリーンアップのために作りたての80%エタノールを使用し、ビーズを過剰乾燥させることなくヌクレアーゼを含まない水で再懸濁する直前に、余分なエタノールをすべて完全に除去してください(ビーズペレットの割れ目は過剰乾燥時に観察されます)。 過剰なアダプターの非アクティブ化に直接進みます。 氷上のすべての試薬を組み立てる小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されているように、過剰なアダプターの不活性化を完了します。 5’4Nアダプターライゲーションに続きます。 5’アダプターの1/4希釈を使用し、氷上のすべての試薬を組み立てることを確認している小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されている完全な5’アダプタライゲーション。 逆転写に進みます。 小さなRNAライブラリー調製キットハンドブックに記載されている完全な逆転写第一鎖合成と氷上のすべての試薬を組み立て、長期間冷凍庫から酵素を保たないように注意してください。注: この時点で、プロトコルは、4 °Cで一晩保存されたサンプルで、停止することができます。 あるいは、PCR増幅を継続する。 小さなRNAライブラリ調製キットハンドブックに記載されている試薬を組み立て、PCRサイクルの数を最小限に抑えることで、PCR増幅を完了します。PCR サイクルの数は、各アプリケーションについて実験的に決定し、最小サイクル数を使用する必要があります。ここでは、小さなRNAライブラリの増幅に16サイクルを使用しました。 サイズ選択に直接進みます。 5. サイズの選択 各サンプルに、6倍のゲルローディング染料とピペットを5 μL加えて混合します。 10 μLのラダーをゲルの最初のウェルに積み込み、すぐに右の空の井戸に残します。ステップ5.1から6%トリス/ホウ酸/エチレンジアナトラ酢酸に全製品をロードし、ポリアクリルアミドゲル(TBE-PAGE)を各サンプルの間に1レーン放置します。注:後のステップのためにゲルが入ってきた容器を保管してください。 0.5x TBEランニングバッファで約30〜40分間、ゲルを150Vで実行します(下色帯がゲルの底部近くまで0.5〜1cm)。 ゲルの実行中に1 Lの染色液を作る:SYBRゴールドは0.5x TBEで1:10,000希釈した。 ゲルの走行が終了したら(すなわち、下色帯がゲルの底付近にある)、ゲルの向きに注意してガラス板からゲルを慎重に取り除いてください。 ゲルを元のパッケージのトレイに入れる。0.5x TBEを取り外し、ステップ5.5の染色溶液で交換します。15分間の染色ゲル。染色時間を増やす必要があるかもしれません。 ゲルをUVトランスイルミエーターに置き、ゲルを裂かないように注意し、上記の向きを維持します(はしごのバンドがはっきりと見えない場合は、追加の時間のために再染色)。 カメラでUVトランスイルミエーターで染色が完了したら、ゲルを画像化します。 より良い画像が必要な場合は、UVトランイルミエータ上のバンドをUVトランイルミエーターで直接イメージングする前に、UVトランスイルミエータ以外のイメージング装置を使用してゲルの画像をキャプチャすると、 図3A-Bに示すように背景の色が変化する。繊細で破れる可能性があるため、ゲルを何度も動かさないで下さいます。 きれいなカミソリの刃を使用して~150 bpバンドを識別して取り外し、きれいな1.5 mLチューブに入れなさい。~130 bp帯(アダプターダイマー製品)を切り取らないでください。 ドキュメント化のためにライブラリ製品を含むスライスを取り除いた後、ゲルを再びイメージします。 ゲルスライスを含むマイクロ遠心チューブを最高速度で30s回転し、各チューブの底部のスライスを収集します。 各サンプルにp200チップを使用して、ゲルのスライスを可能な限り最小のビットに粉砕します。各先端を各チューブに取り出します。 各チューブに溶出バッファーを300 μL加え、チューブの側面からゲルビットを洗浄し、p200チップを再び取り付け、サンプルごとにチップを洗い流します。 溶出サンプルを25°Cに設定した振れインキュベーターに入れます。 1000 rpmの振盪で一晩インキュベートする。インキュベーターからチューブを取り外し、室温で10分間最高速度でスピンします。 ライブラリ製品を含む上清を2 mL RNaseフリー96ウェルプレートに移します。ゲルを転写しないように注意してください。 各サンプルに50 μLのクリーンアップビーズを加え、ピペットで混ぜます。すぐに、イソプロパノールの350 μLを加え、ピペットで混ぜます。ロッキングで10分間室温でインキュベートします。 パルススピンプレートをペレットビーズにし、2分間磁化します。上清を慎重に取り出して捨てます。 80%エタノールの950 μLを加えます。30 sのインキュベート。上清をすべて取り除く。合計2回のエタノールを繰り返します。 サンプルを3分間乾燥させます。このステップでは、各ウェルの底部に集まる残留エタノール(複数回)を除去し、ビーズを過度に乾燥させないように注意してください(過剰乾燥するとビーズペレットの割れになります)。 ウェルの底に残った液体をすべて取り除きます。磁気スタンドからプレートを取り外します。 ペレットを13 μLの再懸濁液バッファーに再懸濁します。均質になるまでピペットで混ぜます。2分間インキュベートし、3分間磁化します。 12 μLの上清をクリーンチューブまたはクリーニングプレートに移し、その後の保管を行います。すべてのサンプルを一晩または-20 °Cの長期保存してください。 毛細管電気泳動高感度DNAアッセイを用いて、各ライブラリーに存在する断片のサイズと濃度を確認します。複数の方法で濃度を確認します。注: キャピラリー電気泳動の過負荷を避けるために、標準感度キットを使用することがあります。