马铃薯病毒基于马铃薯的X型微RNA沉默（VbMS）。

植物微RNA （miRNA） 的特征是 20–24 个核苷酸长、核编码的调节性 ^RNA1 ，在植物生物过程的几乎每个方面都起着重要作用，包括生长和发育^2、3、光合作用和代谢^{4、5、6、7}、激素合成和信号传导^8、9、生物和非生物反应^{10，11，12，13}，以及营养和能量调节^14，15。植物miRNA的调节作用是良好编程的，通常在转录后水平上通过切割或翻译抑制靶标mRNA来实现。

在马铃薯中miRNA的鉴定、转录谱分析和靶标预测方面取得了巨大进展^{16、17、18、19、20、21}。然而，由于缺乏高效和高通量的遗传方法，包括马铃薯在内的植物中miRNA的功能表征落后于其他生物体。通过标准功能丧失分析对单个miRNA进行功能分析具有挑战性，因为大多数miRNA属于具有相当遗传冗余的家族²²。此外，单个miRNA可以控制多个靶基因²³ ，几个不同的miRNA可以协同调节相同的分子途径^24，25。这些特性使得难以表征特定miRNA或miRNA家族的功能。

miRNA的大部分功能分析在很大程度上依赖于具有明显局限性的功能增益方法。人工miRNA（amiRNA）方法利用内源性原代转录本（pri-miRNA）在高水平上产生miRNA，从而抑制靶基因表达^{26，27，28，29}。然而，使用强本构35S启动子的活化标记和miRNA过表达通常会导致miRNA的表达升高，这些表达不代表体内条件，因此可能无法反映^miRNA30的内源性功能。已经开发了一种替代方法，涉及表达在结合和/或切割位点中含有不易脱位突变的靶基因的miRNA抗性形式^31，32，33。但是，由于转基因伪影，这种方法也可能导致对源自miRNA耐药靶基因的表型的误解。因此，应谨慎从这些功能获得研究中得出结论³⁴。上述方法的另一个主要局限性是它们需要转换，这是劳动密集型和耗时的。此外，转基因依赖性方法几乎不适用于顽固的植物物种。因此，必须开发一种快速有效的功能丧失方法来解开miRNA的功能。

为了绕过转化过程的先决条件，通过将靶向模拟（TM）策略与病毒衍生载体相结合，建立了基于病毒的microRNA沉默（VbMS）。在VbMS系统中，人工设计的TM分子从病毒骨架瞬时表达，为解剖植物内源性miRNA的功能提供了一种功能强大，高通量和省时的工具^35，36。VbMS最初是在边 楸 和番茄中与烟草拨浪鼓病毒（TRV）^35，36，37 一起开发的，并且已经扩展到拟南芥，棉花，小麦和玉米，使用各种其他病毒表达系统，包括马铃薯病毒X（PVX）³⁸，棉花屑病毒（ClCrV）³⁹，黄瓜花叶病毒（CMV）^40，41，42，中国小麦花叶病毒（CWMV）⁴³和大麦条纹花叶病毒（BSMV）^44，45。

马铃薯（Solanum tuberosum）是世界上第四大粮食作物，也是种植最广泛的非藜麦作物，主要是因为它具有高营养价值、高能量产量和相对较低的投入要求⁴⁶。马铃薯的几个特点使其成为一种有吸引力的双子叶植物模型植物。它是一种营养繁殖的多倍体作物，具有高越交率，杂合性和遗传多样性。然而，迄今为止，还没有报告使用VbMS表征马铃薯中miRNA的功能。在这里，我们提出了一种基于结扎独立克隆（LIC）的马铃薯PVX的VbMS方法来评估miRNA在马铃薯植物中的功能³⁸。我们选择了miR165/166家族来说明VbMS测定，因为miR165/166家族及其靶标mRNA和III类同源域/Leu拉链（HD-ZIP III）转录因子已被广泛表征^22，47，48。 HD-ZIP III 基因是分生组织发育和器官极性的关键调节因子，miR165/166功能的抑制导致 HD-ZIP III 基因表达增加，导致顶端优势降低和叶极性异常模式等多向性发育缺陷^{22，35，38，41}.与miRNA165/166沉默相关的易于评分的发育表型能够准确评估基于PVX的VbMS测定的有效性。

在这项研究中，我们证明了基于PVX的VbMS系统可以有效地阻断马铃薯中miRNA的功能。由于基于PVX的病毒诱导基因沉默（VIGS）系统已经在许多马铃薯品种中建立^{49，50，51，52}，因此这种基于PVX的VbMS方法可能适用于广泛的二倍体和四倍体马铃薯品种。