Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.
Abstract
Commensal Bakterien sind gut etabliert, um Infektion von eukaryotischen Viren zu beeinflussen. Die direkte Bindung zwischen dem Erreger und dem Wirtsmikrobiom ist für die Veränderung der Infektion für viele dieser Viren verantwortlich. Daher ist die Charakterisierung der Natur der Virus-Bakterien-Bindung ein grundlegender Schritt, der notwendig ist, um den Mechanismus(n) aufzuklären, durch den Bakterien eine Virusinfektion verändern. Für menschliche norovirus, kommensale Bakterien verbessern B-Zell-Infektion. Das Virus bindet direkt an diese Bakterien, was darauf hindeutet, dass diese direkte Interaktion in den Mechanismus der Infektion Verbesserung beteiligt ist. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Viren zu quantifizieren, einschließlich Szintillationszählung von radioaktiv markierten Viren und Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Beide Methoden erfordern die Verwendung von live-Virus, die möglicherweise im Labor erzeugt werden müssen. Derzeit ist keines der etablierten In-vitro-Kultursysteme, die für humane Noroviren verfügbar sind, robust genug, um die Erzeugung hochkonzentrierter Virusbestände zu ermöglichen. Anstelle von lebenden Viren wurden virusähnliche Partikel (VLPs) verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Norovirus und Bakterien zu charakterisieren. Hierbei wird eine Durchflusszytometriemethode mit virusspezifischen Antikörpern beschrieben, um die VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Bakterien zu quantifizieren. Die Einbeziehung sowohl von Bakterien als auch isotypischer Kontrollen ermöglichte die Optimierung des Assays, um die Hintergrundantikörperbindung und die genaue Quantifizierung der VLP-Bindung an die getesteten Bakterien zu reduzieren. Hohe VLP:Bakterien-Verhältnisse führen dazu, dass VLPs an große Prozentsätze der Bakterienpopulation binden. Wenn jedoch die VLP-Mengen verringert werden, nimmt auch der Anteil der gebundenen Bakterien ab. Letztlich kann diese Methode in zukünftigen Experimenten verwendet werden, um die spezifischen Bedingungen und strukturellen Komponenten zu klären, die norovirus regulieren: bakterielle Wechselwirkungen.
Introduction
Humane Noroviren (HuNoVs) sind die Hauptursache für Magen-Darm-Erkrankungen weltweit, verantwortlich für 685 Millionen Infektionen und über 200.000 Todesfälle pro Jahr1. Wie bei anderen enterischen Viren, das Vorhandensein von kommensalen Bakterien hat gezeigt, dass die Infektion dieses Erregers sowie sein Ersatzvirus, murines Norovirus2,3zu verbessern. Es gibt auch widersprüchliche Berichte, dass Bakterien infektiondurch menschliche sonrovirushemmenkönnen 4,5,6. Bei mehreren Viren scheint die direkte Interaktion zwischen dem Virus und Bakterien den Mechanismen zugrunde zu liegen, die dieVirusinfektion2,7,8,9,10, und es wurde durch Elektronenmikroskopie gezeigt, dass menschliche Noroviren direkt an die Oberflächen von Bakterien binden11,12. Daher ist die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung der Mechanismen geworden, durch die Bakterien die Virusinfektion beeinflussen. Diese Charakterisierung hat klassisch mit der Quantifizierung der viralen Bindung an eine Reihe von Bakterienarten begonnen, die Bestandteile des Wirtsmikrobioms7,12,13sind. Diese Anhang Assays offenbaren nicht nur die Menge an Virus an Bakterien gebunden, sondern auch helfen bei der Bestimmung der Auswirkungen dieser Interaktion auf virale Fitness und Überleben.
Zur Quantifizierung der viralen Anhaftung umfassen traditionell verwendete Methoden PCR-basierte Assays, die virale Genome12 oder die Erzeugung von radioaktiv markierten Viren quantifizieren, und die Verwendung von Szintillationszählungen zur Quantifizierung viraler Teilchen7,8,9,13. Die Anwendung dieser Methoden erfordert in der Regel den Zugang zu Beständen mit hohem Titervirus und In-vitro-Anbautechniken, mit denen sie erzeugt werden können. Während mehrere Kultursysteme für menschliches Norovirus jetzt2,14,15, keines unterstützt die robuste Replikation erforderlich, um diese hochkonzentrierten Bestände zu generieren, die die Verwendung von PCR und Szintillationszählung begrenzt oder eliminiert, um menschliche Norovirus/Bakterien-Wechselwirkungen zu quantifizieren.
Um dieses Problem zu umgehen, können virusähnliche Partikel (VLPs) als Ersatz für lebende Viren verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien zu untersuchen16,17. VLPs sind nicht-infektiöse Partikel, die dem Virus, von dem sie abgeleitet werden, sehr ähnlich sind. Beim menschlichen Norovirus werden diese Teilchen aus der Expression des VP1-Proteins (und irgendwann des VP2-Proteins) erzeugt, das sich selbst zusammensetzt, um intakte virale Kapsiden ohne genetisches Material (d.h. RNA für Noroviren) zu erzeugen. Diese VLPs sind gut charakterisiert, sind strukturell und antigen ähnlich wie die Wildtypviren, von denen sie abgeleitet sind18,19,20,21,22,23. Daher dienen VLPs als ideales Ersatzfürst, um die Oberflächenwechselwirkungen zwischen humanen Noroviren und Kommensalen zu untersuchen. Da VLPs an genetischem Material fehlen, können PCR-basierte Assays nicht zur Quantifizierung der viralen Bindung verwendet werden. Eine Antikörper-basierte Durchflusszytometrie-Methode wurde zuvor beschrieben und konnte niedrige KONZENTRATIONen von VLP-Bindung an Bakterien semiquantitativ erkennen16. Diese Methode wurde optimiert, um eine genaue Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Commensalbakterien zu ermöglichen16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fähigkeit, die Bindung von enterischen Viren an Bakterien zu quantifizieren, ist ein entscheidender erster Schritt, um die Mechanismen aufzuklären, mit denen diese Bakterien eine Virusinfektion verändern. Die hier beschriebenen Methoden wurden optimiert, um menschliche Norovirus-VLP-Wechselwirkungen mit E. cloacae (gramnegatives Bakterium) und L. gasseri (ein grampositives Bakterium) zu messen, können aber für die Verwendung mit jedem Säugetiervirus und Bakteri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Sutonuka Bhar und Chanel Mosby-Haundrup für ihre kritische Überprüfung des schriftlichen Manuskripts sowie Alfonso Carrillo für die Unterstützung bei der Erzeugung bakterieller Standardkurven. Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Stipendium des National Institute of Health (R21AI140012) und durch ein Saatgutstipendium der University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, finanziert.
Materials
| 5ml Polystrene Round-Bottom Tubes with Cell-Strainer Cap | Corning | 352235 | After antibody staining, sample are transferred into tubes for flow cytometry analysis. |
| Agar | Sigma | A7002 | Used for media preparation |
| AnaeroPack | Thermo Scientific | R681001 | Anaerobic gas pack used for culture of Lactobacillus gasseri |
| BD FacsDiva software | |||
| BD LSR Fortessa flow cytometer | |||
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP1605 | Used for flow cytometry |
| Flow Cytometry Stain Buffer (FCSB) | BD Biosciences | 554657 | Used for flow cytometry |
| Mouse IgG2b kappa Isotype Control (eBMG2b), PE, eBioscience | Thermo Fisher Scientific | 12473281 | Isotype control. This antibody is purchased in the conjugated form from the manufacturer. |
| MRS Powder | BD Biosciences | 288130 | Used for media preparation and to culture Lactobacillus gasseri. |
| Norovirus capsid G2 Monoclonal Antibody (L34D) | Thermo Fisher Scientific | MA5-18241 | Norovirus GII antibody. This antibody is only available in the unconjugated form and thus must be fluorescently conjugated prior to use in the outlined flow cytometry assays. In this protocol, PE was the chosen fluor, however, other fluorescent molecules can be chosen as best suits the flow cytometer being used by the researcher. |
| Norovirus GII.4 VLP | Creative Biostructure | CBS-V700 | human norovirus virus like particle, VLPs were generated using the baculovirus system and resuspended in phosphate buffered saline with 10% glycerol. The authors performed independent nanosight tracking analysis to determine the particle concentration of the VLPs. The concentration is approximately 1011 VLPs per milliliter. Based on the protein concentration of the VLPs, approximately 200 particles are added per bacterium in VLP attachment assays. |
| PBS 10X | Fisher Bioreagents | BP665 | Dilute to 1X prior to use. |
| SiteClick R-PE Antibody Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | S10467 | Conjugation kit used for labling of unconjugated antibody. |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Used for media preparation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Used for media preparation |
| Tube Revolver | ThermoFisher Scientific | 88881001 | Used in virus:bacterium attachment assay. Set to max speed (40 rpm). |
| Yeast Extract | BD Biosciences | 212750 | Used for media preparation |
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