JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

إنتاج وتوصيف القالفات البشرية من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Published: April 16, 2020
doi:
10.3791/61038
, , , , , , ,
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine,University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen’s Medical Research Institute,University of Edinburgh

Summary

يصف هذا البروتوكول الجيل القوي من الضامة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من الإنسان، وطرق توصيفها اللاحق. يتم استخدام تعبير علامة سطح الخلية، والتعبير الجيني، والمقالات الوظيفية لتقييم النمط الظاهري ووظيفة هذه الضامة المشتقة من iPSC.

Abstract

الضامة موجودة في معظم الأنسجة الفقارية وتشمل مجموعات خلايا مشتتة وغير متجانسة على نطاق واسع ذات وظائف مختلفة. هم لاعبين رئيسيين في الصحة والمرض، ويتصرفون كالبلوcycytes خلال الدفاع المناعي والتلاعب التروفي، والصيانة، وإصلاح وظائف. على الرغم من أنه كان من الممكن دراسة بعض العمليات الجزيئية التي تنطوي عليها وظيفة الضامة البشرية ، فقد ثبت أنه من الصعب تطبيق تقنيات الهندسة الوراثية على الضامة البشرية الأولية. وقد أعاق ذلك إلى حد كبير قدرتنا على استجواب المسارات الجينية المعقدة التي تنطوي عليها بيولوجيا الضامة وتوليد نماذج لدول مرض محددة. ولذلك فإن وجود مصدر جاهز للضامة البشرية قابل للترسانة الهائلة من تقنيات التلاعب الجيني سيوفر أداة قيمة في هذا المجال. نحن نقدم بروتوكول الأمثل الذي يسمح لتوليد الضامة من الخلايا الجذعية المستحثة البشرية (iPSCs) في المختبر. هذه الالضامة المشتقة من iPSC (iPSC-DMs) تعبر عن علامات سطح الخلية الضامة البشرية ، بما في ذلك CD45 و 25F9 و CD163 و CD169 ، والقول الوظيفي للتصوير بالخلايا الحية يوضح أنها تظهر نشاطًا أبواليًا قويًا. يمكن تنشيط iPSC-DMs المثقف إلى حالات الضامة المختلفة التي تعرض التعبير الجيني المتغير والنشاط البلعوم عن طريق إضافة LPS و IFNg أو IL4 أو IL10. وهكذا، يوفر هذا النظام منصة لتوليد الضامة البشرية التي تحمل التعديلات الوراثية التي نموذج مرض بشري معين ومصدر للخلايا لفحص المخدرات أو العلاج بالخلايا لعلاج هذه الأمراض.

Introduction

تمثل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) مصدر خلايا تجديد ذاتي يمكن تمييزه لإنتاج خلايا من جميع الأنساب الثلاثة للطبقة الجرثومية. التكنولوجيات التي تسمح للتلاعب الجيني للخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (PSCs), مثل الزنك إصبع Nuclease, TALENS, وCRISPR-Cas9, وقد أحدث ثورة البحوث الطبية1,,2,,3,,4. التلاعب الجيني للPSCs الإنسان هو استراتيجية جذابة بشكل خاص عندما الخلية الأساسية من الفائدة من الصعب توسيع و / أو للحفاظ في المختبر، أو من الصعب التلاعب وراثيا ، مثل الحال للالضامة5،6،7،8،9. وبما أن الـ iPSCs البشرية يمكن اشتقاقها من أي خلية جسدية، فإنها تتحايل على القيود الأخلاقية المرتبطة بالشركات المتكاملة، وتوفر استراتيجية لتقديم الأدوية الشخصية. وهذا يشمل نمذجة المرض الخاصة بالمريض ، واختبار المخدرات ، والعلاج بالخلايا الذاتية مع انخفاض خطر الرفض المناعي والعدوى6،8،10،11.

وتتألف البروتوكولات التي تصف توليد الضامة من الـ iPSCs من عملية من ثلاث خطوات تشمل: 1) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ (2) توليد الأجسام الجنينية؛ ( 2) ظهور الخلايا الهيماتوبويتيك في التعليق؛ 3) نضوج الضامة الطرفية.

تكوين المجاميع ثلاثية الأبعاد، والمعروفة باسم الأجسام الجنينية (EBs) يبدأ التمايز بين iPSCs. يتم إضافة البروتين المورفوجيني (BMP4) ، عامل الخلايا الجذعية (SCF) ، وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) لدفع مواصفات mesoderm ودعم الخلايا الهيماتوبويتيك الناشئة7،8،9،11،12. كما تبدأ الخلايا المتمايزة داخل الـ EBs في تنشيط مسارات الإشارات الذاتية مثل Wnt و Activin. بعض بروتوكولات التمايز لا تمر مرحلة تشكيل EB. في هذه الحالات، تتم إضافة المنظمين إشارات Wnt وActivin، مثل أكتيفين A الإنسان المؤتلف و / أو تشيرون إلى iPSCs المتباينة في شكل أحادي ة13،14،15. هنا، نركز على بروتوكول يستخدم تشكيل EB. بالنسبة للخطوة الثانية من التمايز ، يتم مطلي EBs على سطح ملتصق. ثم تتعرض هذه الخلايا المرفقة للسيتوكينات التي تعزز ظهور خلايا التعليق التي تشمل السلف الهيماتوبويتيك والنخاعي. في هذه الظروف في ثقافة المختبر, interleukin-3 (IL3) يدعم على الأرجح تكوين الخلايا الجذعية السلف الهيماتوبوبوتيرية وانتشار16,,17,فضلا عن انتشار السلائف النخاعية والتمايز18. عامل تحفيز مستعمرة الضامة (CSF1) يدعم إنتاج الخلايا النخاعية وتمايزها إلى الضامة19,20. خلال المرحلة الثالثة من التمايز ، يتم استزراع هذه الخلايا المعلقة في وجود CSF1 لدعم نضوج الضامة الطرفية.

إن تمايز الـ iPSCs البشري إلى الضامة في المختبر يحاكي الموجة المبكرة من إنتاج الضامة أثناء التنمية. يتم إنشاء الضامة المقيمة في الأنسجة أثناء تكوين الأجنة ولها نسب نمائي متميز من الخلايا الأحادية للبالغين. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن iPSC-DMs لها توقيع جيني أكثر قابلية للمقارنة مع الضامة المشتقة من كبد الجنين من الخلايا الأحادية المشتقة من الدم، مما يشير إلى أن iPSC-DMs أقرب إلى الضامة المقيمة في الأنسجة. iPSC-DMs التعبير عن مستويات أعلى من الجينات التي ترميز لإفراز البروتينات المشاركة في إعادة عرض الأنسجة وتولد الأوعية والتعبير عن مستويات أقل من ترميز الجينات لإفراز السيتوكين الموالية للالتهابات وأنشطة عرض مستضد21,22. وبالإضافة إلى ذلك، iPSC-DMs لديها شرط عامل النسخ مماثلة لتلك الضامة المقيمين في الأنسجة23،24. باستخدام خطوط الخلية iPSC خروج المغلوب التي هي ناقصة في عوامل النسخ RUNX1، SPI1 (PU.1)، وMYB، Buchrieser وآخرون أظهرت أن جيل iPSC-DMs هو SPI1 و RUNX1 تعتمد، ولكن MYB مستقلة. وهذا يشير إلى أنها تشبه بشكل نسخ يصفار كيس الضامة المشتقة التي يتم إنشاؤها خلال الموجة الأولى من الهيماتوبوز خلال التنمية23. لذلك ، من المقبول على نطاق واسع أن iPSC-DMs تمثل نموذجًا أكثر ملاءمة للخلايا لدراسة الضامة المقيمة في الأنسجة مثل خلايا microglia14و25 و Kupffer11، ومصدرًا أكثر جاذبية للخلايا التي يمكن استخدامها في العلاجات لإصلاح الأنسجة. على سبيل المثال، فقد تبين أن الضامة المنتجة في المختبر من ESCs الماوس كانت فعالة في تحسين التليف في نموذج إصابة الكبد الناجم عن CCl4 في الجسم الحي11. وعلاوة على ذلك، كانت هذه الضامة المشتقة من ESC أكثر كفاءة من الضامة المشتقة من نخاع العظم في إعادة ملء مقصورات خلايا كوفير المستنفدة من الضامة باستخدام الكلورونات الدهنية11 في الفئران.

هنا، نحن نصف المصل وبروتوكولات خالية من المغذية لصيانة وتجميد وذوبان iPSCs الإنسان، والتمايز من هذه iPSCs في الضامة وظيفية. هذا البروتوكول مشابه جدا ً للبروتوكول الذي وصفه فان ويلغنبورغ وآخرون12،مع تعديلات طفيفة بما في ذلك: 1) وسائط صيانة iPSC؛ 1) وسائط الصيانة iPSC؛ 1) وسائط الصيانة iPSC؛ 1 2) لا يستخدم مثبط الصخور في مرحلة تشكيل EB؛ 3) يتم استخدام نهج ميكانيكي بدلا من نهج أنزيمي لتوليد EBs موحدة من مستعمرات iPSC؛ 4) طريقة حصاد EB والطلاء لأسفل مختلفة؛ 5) يتم حصاد خلايا التعليق 2x في الأسبوع، بدلا من الأسبوع؛ و 6) يتم استزراع خلايا التعليق حصادها تحت CSF1 لنضوج الضامة لمدة 9 أيام بدلا من 7 أيام. كما نقوم بوصف البروتوكولات المستخدمة لتوصيف النمط الظاهري للبلع ومُنقّف البلعوم المشتق من iPSC، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني (qRT-PCR)، وتعبير علامة سطح الخلية (قياس التدفق الخلوي)، والمقالات الوظيفية لتقييم البلعوم والاستقطاب.

Protocol

ملاحظة: يتم سرد جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يجب أن تكون الوسائط عند 37 درجة مئوية لثقافة الخلية. ويجب أن تكون وسائط الإعلام والكواشف المستخدمة في بروتوكول التمايز عقيمة. 1. الإنسان iPSC خط ذوبان والصيانة إعداد وسيط صيانة الخلية وعوامل النمو والكواشف الأخرى. إعداد hESC المصل وسائل الإعلام الحرة (hESC-SFM; انظر جدول المواد)عن طريق استكمال جلش تعديل دولبكو المتوسطة F12 (DMEM/F12) مع ملحق hESC, 1.8% ث / v الزلم البقري (BSA), و 0.1 mM 2-mercaptoethanol. ( إعداد الإنسان الأساسية عامل نمو الخلايا الليفية (bFGF) محلول المخزون (10 ميكروغرام / مل) عن طريق حل bFGF في معقم 0.1٪ ألبوم مصل الإنسان (HSA)-الفوسفات المؤقتة محلول المالحة (PBS). توزيع محلول المخزون كـ 200 ميكرولتر العليوت في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى سنة واحدة. بمجرد إذابة الأسهم ، يمكن تخزين bFGF في 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام. إعداد مثبط رو كيناز (مثبط الصخور)-Y27632 محلول الأسهم (1 ملغ/مل) عن طريق إذابة في الماء المعقم. توزيع محلول المخزون كما 50 μL aliquots في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى سنة واحدة. بمجرد إذابة، يمكن تخزين مانع الصخور الأسهم في 4 درجة مئوية لمدة 7 أيام. تمييع الركيزة الخلايا الجذعية (انظر جدول المواد)1:50 في السالين فوسفات العازلة Dulbecco مع الكالسيوم والمغنيسيوم. ضع محلول ركيزة الخلايا الجذعية المخفف على لوحات الثقافة بحيث يكون الحجم النهائي لكل مساحة سطح 78 ميكرولتر / سم2. لمعطف بئر من 6 لوحة بئر، إضافة 750 ميكرولتر من الحل. احتضان لوحة المغلفة لمدة 1 ساعة في جو مهاج في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. استنشق طلاء الركيزة الخلايا الجذعية وإضافة 1 مل من hESC تكملها 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر روك المانع. لإذابة قارورة من الخلايا iPSC البشرية المجمدة، واحتضان القارورة في 37 درجة مئوية حتى إذابة ونقل الخلايا إلى 5 مل hESC-SFM الوسائط. خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 3 دقيقة. إعادة تعليق في 0.5 مل hESC-SFM تستكمل مع 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر روك المانع. نقل الخلايا إلى المغطى جيدا. خلايا الثقافة ل24 ساعة. تغيير وسائل الإعلام إلى hESC-SFM تستكمل مع 20 نانوغرام / مل bFGF، ولكن من دون مثبط الصخور. للحفاظ على الخلايا، قم بتغيير الوسط كل يوم حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80٪. عادة ما تستغرق iPSCs غير المتمايزة 3-4 أيام للوصول إلى التقاء 80٪. مرة واحدة قد وصلت الخلايا 80٪ التقاء، وخلايا المرور. استبدال متوسط الثقافة المستهلكة مع 1.5 مل من hESC-SFM الطازجة تكملها 20 نانوغرام / مل bFGF (بدون مثبط الصخور). عقد وعاء الثقافة في يد واحدة ولفة أداة تمرير الخلية المتاح (انظر جدول المواد)عبر لوحة في اتجاه واحد (أي، من اليسار إلى اليمين). يجب أن جميع ريش في الأسطوانة يكون لمس لوحة. الحفاظ على الضغط موحدة أثناء المتداول. كرر المتداول في نفس الاتجاه حتى يتم تغطية البئر كله. تدوير وعاء الثقافة 90 درجة وتكرار المتداول على النحو المبين في الخطوات 1.12.2 و 1.12.3. تجاهل أداة التمرير بعد الاستخدام. مع ماصة معقمة، استخدم وسائل الإعلام في البئر لطرد المستعمرات المقطوعة. نقل الخلايا بنسبة 1:4 على آبار الركيزة الخلايا الجذعية المغلفة مسبقا (الخطوات 1.2-1.5) إلى حجم الوسائط النهائية (hESC-SFM تستكمل مع 20 نانوغرام / مل bFGF) من 1.5 مل لكل بئر. 2. خط iPSC الإنسان تجميد لتجميد خلايا iPSC، استبدال وسائل الإعلام من 70٪-80٪ بئر confluent من لوحة جيدة 6 مع hESC-SFM تكملها 20 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر روك المانع. احتضان جيدا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 1 ساعة. قطع المستعمرات مع أداة تمرير الخلية ووضع المستعمرات طرد في أنبوب الطرد المركزي. خلايا الطرد المركزي في 100 × ز لمدة 3 دقيقة. ينسخ الوسائط وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسائط الحفاظ على التبريد الخلية (انظر جدول المواد). تقسيم الخلايا بالتساوي إلى اثنين من cryovials ووضعها في حاوية حفظ التبريد الخلية المبردة مسبقا في 4 درجة مئوية. تخزين الخلايا في -80 درجة مئوية لمدة 24-48 ساعة. نقل القنينات إما إلى ثلاجة -135 درجة مئوية أو إلى خزان النيتروجين السائل. 3. تمايز iPSC الإنسان إلى الضامة ملاحظة: ويرد موجز تخطيطي لبروتوكول التمايز الضامة في الشكل 1. إعداد عوامل نمو التمايز الخلوي والكواشف الأخرى إعداد وسائط hESC-SFM (انظر القسم السابق). إعداد 0.1٪ ث / الخامس محلول الجيلاتين بورسين عن طريق إذابة الجيلاتين في الماء المعقم. يمكن تخزين محلول الجيلاتين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى عامين. إعداد محلول مخزون BMP4 البشري (25 ميكروغرام/مل) عن طريق إذابة BMP4 في كلوريد هيدروجين 4 mM (HCl)-0.2% محلول BSA PBS. توزيع محلول المخزون كما 50 μL aliquots في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى سنة واحدة. بمجرد إذابة، يمكن تخزين الأسهم BMP4 في 4 درجة مئوية لمدة 5 أيام. إعداد محلول مخزون VEGF البشري (100 ميكروغرام/مل) عن طريق إذابة VEGF في محلول PBS BSA 0.2%. توزيع محلول المخزون كما العليوت 10 ميكرولتر في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى سنة واحدة. بمجرد إذابة ، يمكن تخزين VEGF الأسهم في 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام. إعداد محلول مخزون SCF البشري (100 ميكروغرام/مل) عن طريق إذابة SCF في محلول PBS BSA بنسبة 0.2%. توزيع محلول المخزون كـ 5 μl aliquots في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى سنة واحدة. بمجرد إذابة الأسهم، يمكن تخزين الأسهم SCF في 4 درجة مئوية لمدة 10 أيام. إعداد محلول الأسهم IL3 الإنسان (10 ميكروغرام / مل) عن طريق حل IL3 في 0.2٪ BSA PBS الحل. توزيع محلول المخزون كـ 500 ميكرولتر العليوت في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى 2 سنوات. بمجرد إذابة الأسهم، يمكن تخزين الأسهم SCF في 4 درجة مئوية لمدة 15 يوما. إعداد محلول مخزون CSF1 البشري (10 ميكروغرام/مل) عن طريق حل CSF1 في محلول PBS BSA 0.2%. توزيع محلول الأسهم كما 1 مل aliquots في الأنابيب الجليدية. يمكن تخزين حلول الأسهم في -20 درجة مئوية تصل إلى 2 سنوات. بمجرد إذابة الأسهم، يمكن تخزين الأسهم SCF في 4 درجة مئوية لمدة 15 يوما. إعداد حلول منفصلة 10 ميكروغرام /مل مخزون من إنترفيرون غاما (IFNg)، إنترلوكين 4 (IL4)، وإنترلوكين 10 (IL10) عن طريق حل في 0.2٪ BSA PBS الحلول. إعداد lipopolysaccharide (LPS) إلى حل الأسهم من (100 U / mL) عن طريق إذابة في حل 0.2٪ BSA PBS. توزيع كل حل الأسهم كما aliquots 35 ميكرولتر. تخزين في -80 درجة مئوية تصل إلى 2 سنوات. بمجرد إذابة، يمكن تخزين الأسهم في 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام. المرحلة الأولى: توليد الأجسام الجنينية (اليوم 0-اليوم الثالث) في اليوم 0، إضافة 2.25 مل من المرحلة 1 وسائل الإعلام (hESC-SFM تستكمل مع 50 نانوغرام / مل BMP4، 50 نانوغرام / مل VEGF، و 20 نانوغرام / مل SCF) في اثنين من الآبار من مرفق ultralow 6 لوحة بئر. استبدال وسائل الإعلام صيانة واحدة 80٪ بئر confluent من iPSCs في لوحة جيدة 6 مع 1.5 مل من المرحلة 1 وسائل الإعلام. قطع المستعمرات باستخدام أداة تمرير الخلية ونقل قطع المستعمرات مع ماصة في بئرين من مرفق ultralow 6 لوحة جيدا (انظر جدول المواد). في اليوم 2، جلب السيتوكينات إلى تركيز نهائي من 50 نانوغرام/ مل BMP4، 50 نانوغرام/مل VEGF، و 20 نانوغرام/مل SCF باستخدام 0.5 مل من الوسائط hESC-SFM.ملاحظة: ستصبح مستعمرات IPSC EBs(الشكل 2A). المرحلة الثانية: ظهور الخلايا الهيماتوبويتيك في التعليق في اليوم 4، معطف 4 آبار من 6 لوحة زراعة الأنسجة الآبار مع 0.1٪ ث / ث الجيلاتين واحتضان لمدة 10 دقيقة على الأقل. إزالة الجيلاتين وإضافة 2.5 مل من المرحلة 2 وسائل الإعلام (X-VIVO15 تستكمل مع 100 نانوغرام / مل CSF1، 25 نانوغرام / مل IL-3، 2 mM غلوتاماكس، 1٪ البنسلين-العقديات، و 0.055 mM 2-mercaptoethanol). جمع EBs شكلت في أنبوب الطرد المركزي 50 مل والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية. يُستنشق وسائل الإعلام بعناية. إعادة تعليق EBs في 2 مل من المرحلة 2 وسائل الإعلام. نقل 10-15 EBs (لا يزيد عن 15) إلى بئر مغلفة بالجيلاتين تحتوي على 2.5 مل من وسائط المرحلة 2. احتضان EBs في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 الهواء. تغيير وسائل الإعلام على EBs مطلي كل 3-4 أيام لمدة 2-3 أسابيع. بعد 2-3 أسابيع، تبدأ EBs الإفراج عن الخلايا الهيماتوبويتيك غير المنضمة إلى التعليق.ملاحظة: يمكن أن تختلف هذه الفترة من إصدار خلية التعليق وهي تعتمد على خط الخلية. يمكن حصاد الخلايا في هذا التعليق ونضجها في الضامة (انظر المرحلة 3)(الشكل 2A). المرحلة الثالثة: نضوج الضامة الطرفية جمع تعليق خلايا الهيماتوبوطي وتجديد وسائل الإعلام (المرحلة 2 وسائل الإعلام) على لوحة EB. خلايا تعليق الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 3 دقيقة. إعادة تعليق خلايا التعليق في المرحلة 3 وسائل الإعلام (X-VIVO15 تستكمل مع 100 نانوغرام / مل CSF1, 2 mM غلوتاماكس, و 1% البنسلين-streptomycin). لوحة جمعت ونسج الخلايا على البلاستيك غير المعالجة 10 سم لوحات البكتريولوجية الصف (10 مل) أو غير المصقول 6 لوحات زراعة الأنسجة جيدا (3 مل) بكثافة 0.2 × 106 خلايا / مل. احتفظ بالخلايا في وسائط المرحلة الثالثة لمدة 9-11 يومًا، وتغيير الوسائط كل 5 أيام.ملاحظة: يمكن تكرار الخطوات 3.4.1-3.4.5 من المرحلة 3 كل 3-4 أيام وتحصد خلايا التعليق من لوحة EB الأصلية لمدة تصل إلى 3 أشهر. استقطاب الضامة لتنشيط الضامة إلى النمط الظاهري M (LPS + IFNg) ، قم بتنشيط الخلايا مع LPS (التركيز النهائي: 100 نانوغرام / مل) وIFNg (التركيز النهائي: 10 U / mL) لمدة 48 ساعة. لتنشيط الخلايا إلى النمط الظاهري M (IL4) ، قم بتنشيط الخلايا مع IL4 (التركيز النهائي: 20 نانوغرام / مل). للتنشيط إلى النمط الظاهري M (IL10) ، قم بتحفيز الضامة مع IL10 (التركيز النهائي: 5 نانوغرام / مل). 4. iPSC المستمدة من التحقق من جودة البلجية تحديد عدد خلايا التعليق الهيماتوبويتيك المنتجة لكل 6 صفيحة بئر من EBs عن طريق عدها باستخدام مقياس الخلايا اللوهية. تقييم مورفولوجيا الضامة كما هو موضح سابقا (على سبيل المثال، تلطيخ عدة التجارية)8،9. الكشف عن التعبير عن علامات الضامة وعلامات الاستقطاب باستخدام تحليلات التعبير الجيني وقياس التدفق الخلوي كما هو موضح سابقا8,9. لتدفق تجارب قياس الخلايا على بئر واحد من 6 لوحة جيدة من الضامة، وخلايا الحصاد عن طريق aspirating وسائل النضج الخاصة بهم، وغسل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، واحتضان لهم مع 2 مل من الإنزيم العازلة الخلايا الحرة لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). ماصة صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا لفصل وحصاد الضامة. عد الخلايا مع قياس الخلايا الدموية وإعادة تعليقها في 80 ميكرولتر من 2٪ BSA، 0.5 mM حمض الإيثيلينديامينtetraacetic (EDTA)-PBS الحل. إضافة 20 ميكرولتر من MACS الإنسان FC مانع. تحضن على الجليد لمدة 20 دقيقة وحماية من الضوء. إضافة حجم مناسب من 2٪ BSA، 0.5 mM EDTA PBS الحل لتحقيق تركيز الخلية إلى 1 × 106 الضامة / مل. وصمة عار 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر من 2٪ BSA، 0.5 mM EDTA PBS الحل مع الأجسام المضادة المقابلة (انظر ملاحظة أدناه) واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT محمية من الضوء. اغسل 1x مع ما لا يقل عن 100 ميكرولتر من 2٪ BSA، 0.5 mM EDTA PBS. إعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من 2٪ BSA، 0.5 mM EDTA PBS. إضافة 4’،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI، المخفف 1:1،000) كصبغة حية ميتة. احتضان 3 دقيقة. لتحليل التدفق الخلوي، بوابة على السكان الرئيسيين، ثم خلايا واحدة، ومن ثم الخلايا الحية. على عدد الخلايا الحية ، والتعبير علامة الضامة ذات الصلة واضح(الشكل 3A).ملاحظة: يجب أن يتم تباً بعناية للأجسام المضادة لكل خط خلية يستخدم لاشتقاق الضامة. الأجسام المضادة المعروضة في قسم النتائج موجودة في جدول المواد. يتم تضمين عامل التخفيف لـ SFCi55 المشتقة من تحليل تدفق الخلايا. 5. ارتفاع الإنتاجية الفياسيتوزأس حصاد iPSC المشتقة من الضامة (iPSC – DMs) عن طريق aspirating وسائل الإعلام ، إضافة الجليد الباردة الخلايا الحرة العازلة العازلة ، واحتضان لمدة 5 دقيقة. جمع الضامة عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا. لوحة 8 × 104 iPSC-DMs في بئر من زراعة الأنسجة التصوير الصف 96 لوحات البئر (على سبيل المثال، Cellcarrier Ultra، بيركين إلمر) قبل يومين على الأقل من التصوير الإنتاجية العالية في 200 ميكرولتر من المرحلة 3 وسائل الإعلام. إعداد pHrodoGreen Zymosan-A الجسيمات الحيوية عن طريق إعادة تعليق قارورة واحدة في 2 مل من PBS (“الحل 1”). حل دوامة لمدة 10 s. تمييع 2 مل من تعليق بي بي إس للزة 1:5 مع المزيد من برنامج تلفزيوني (“الحل 2”). حل Sonicate 2 لـ 8 s وحل الدوامة لمدة 10 s. احتفظ به عند 4 درجات مئوية. سيتم استخدام هذا الحل في الخطوة 5.11. إزالة وسائل الإعلام على مطلي iPSC-DMs وغسل مع برنامج تلفزيوني. وصمة عار iPSC-DMs مع محلول PBS يحتوي على Hoechst 33342 المخفف 1:20. احتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. وصمة عار مع محلول PBS تحتوي على بقعة غشاء البلازما الأحمر العميق المخفف 1:1000 (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. أضف 100 ميكرولتر من محلول البزة المحفوظ ة عند 4 درجات مئوية إلى كل بئر من iPSC-DMs. لوحات الآن جاهزة للتصوير. صورة لوحة باستخدام نظام التصوير عالية المحتوى والحصول على ثلاثة حقول أو أكثر عبر البئر للحصول على تمثيل جيد للبئر. قياس البلعوم باستخدام برنامج كولومبوس (برنامج نظام تحليل التصوير عالي المحتوى). يمكن تطوير خوارزمية معينة لتحليل دفعة الصور التي لا لبس فيها: قياس كثافة زرقاء وتحديد في البرنامج أن إشارة زرقاء يشير إلى النوى. قياس كثافة حمراء وتحديد في البرنامج أن إشارة حمراء يشير السيتوبلازم. تحديد تلك النواة والسيتوبلازم معا يتوافق مع خلية. قياس كثافة خضراء في الخلايا وإنشاء صارمة خفض / عتبة القيمة للنظر في خلية كما البلعوم. قياس كسر الخلية البلعومية ومتوسط مؤشر البلعوم لكل خلية. نظرًا لأن كثافة لون الخرز تتناسب مع عدد الخرز ، يمكن قياس النشاط البلعوم بعدد الخرز الذي تم تناوله. تطبيق خوارزمية / خط أنابيب لجميع الصور داخل كل حقل وفي جميع النقاط الزمنية المكتسبة، مما يسمح لنهج دفعة قوية وغير متحيزة لتحديد قدرات البلعوم من الخلايا.ملاحظة: كولومبوس هو برنامج تحليل المحتوى العالي ، والذي يقدم تحليل تجزئة الخلية لفيوجيبينجيب الخلية والاختبار الوظيفي.

Representative Results

تطور التمايز ، وعدد الضامة ، ومورفولوجياالنتائج المقدمة هي من تمايز خط SFCi55 الإنسان iPSC التي تم وصفها واستخدامها في عدد من الدراسات8،9،10،26. ويمكن رصد عملية التمايز بين اللجنة الدولية لحماية التطبيقات والضامة عن طريق المجهر البصري. كانت مستعمرات iPSC والأجسام الجنينية (EBs) وخلايا التعليق الهيماتوبويتيك والضامة الناضجة متميزة بشكل مورفلوجي(الشكل 2A). ويمكن التحقق من مورفولوجيا الضامة الناضجة عن طريق تلطيخ مستحضرات السيدوسبين الطاردة للمركزية. كانت الضامة المشتقة من IPSC كبيرة ، وكان لها نواة بيضاوية الشكل صغيرة واحدة وسيتوبلازم وفيرة تحتوي على العديد من الحويصلات(الشكل 2B). أول أسبوعين من خلايا التعليق الهيماتوبويتيك حصاد (أيام 16-28) من واحد كامل 6 صفيحة بئر من EBs الواردة، في المتوسط، 2.59 × 106 ± 0.54 الخلايا. وبعد اليوم 28، تم إنتاج ما متوسطه 4.64 × 106 ± 0.94 من الخلايا المعلقة لكل 6 صفيحة بئر من الـ EBs. من اليوم 80 فصاعدا، بدأ عدد خلايا التعليق في الانخفاض كما تصبح EBs استنفدت(الشكل 2C). ويوصى بوقف بروتوكول التمايز بعد أن تنخفض الأرقام إلى أقل من 3 × 106 سلائف لكل حصاد لكل 6 صفيحة بئر من الـ EBs. IPSC المشتقة من علامات سطح الخلية الضامة التعبيرلا يزال قياس التدفق الخلوي الطريقة الأكثر شيوعًا المستخدمة لتقييم النمط الظاهري للقمامالبشرية. تتكون استراتيجية الجاتينغ لتقييم تعبير علامة سطح الخلية من الجاتينغ السكان الرئيسيين للخلايا باستخدام المعلمات الفيزيائية مثل الحجم والحبيبية ، تليها الخلايا المفردة ثم الخلايا الحية(الشكل 3A). يجب أن تعبر الضامة المشتقة من iPSC الناضجة عن علامة النسب CD45 وعلامة نضوج الضامة 25F9 ، وتكون سلبية لعلامة البلمة الأحادية / غير الناضجة CD93. وهذا يتفق مع ملاحظاتنا(الشكل 3A). كانت الضامة المشتقة من IPSC إيجابية أيضًا لعلامات النخاع النخاعي السلالة CD11b و CD14 و CD43 و CD64 و CD115 و CD163 و CD169(الشكل 3B). كانت إيجابية لعلامة التشكيل المناعي CD86 ، ونسبة صغيرة منهم أعربوا عن مستقبلات chemokine CX3CR1 ، CCR2 ، CCR5 ، و CCR8 في الحالة الساذجة(الشكل 3B). تم الحصول على قطع الأراضي من البيانات التي سبق نشرها من قبل مختبرنا8. البلهى المشتقة من iPSC والاستقطابواحدة من السمات الرئيسية للالضامة في الدفاع المضيف والتوازن النسيجي هو قدرتها على مسببات الأمراض البلعوم، والخلايا المبرمجة، والحطام27. يرتبط معدل البلعوم ارتباطًا وثيقًا بدول الفينوتيبيك المحددة28. لتقييم قدرة البلعوم iPSC-DM، استخدمنا نظام التصوير عالية المحتوى نهج8،,9،,11 الذي يجعل من الاستفادة من PerkinElmer Operetta المجهر والجسيمات الحيوية pHrodo Zymosan (pH الحساسة صبغ الاتوجات). كانت الجسيمات الحيوية غير فلورية عند إضافتها إلى الثقافات(الشكل 4A)ولكن فلورسCed الأخضر الساطع في درجة الحموضة الحمضية داخل الخلايا(الشكل 4B). تم تعيين مجهر الأوبريت للتصوير الحي لتصوير كل 5 دقيقة بعد إضافة الخرز لوقت إجمالي قدره 175 دقيقة. ثم تم استخدام خط أنابيب تحليل الصور عالي الإنتاجية وغير المتحيز في منصة كولومبوس لتحديد النشاط من حيث الكسر البلعوم الذي يمثل نسبة الخلايا التي تبلح الخرز وفهرس البلعوم الذي هو مقياس لعدد الخرز الذي تم بلعه كل خلية. يمكن الضامة الاستجابة وتغيير النمط الظاهري اعتمادا على الإشارات البيئية. لتقييم قدرتها على الاستجابة والتغيير على المحفزات البيئية، يمكن معالجة iPSC-DMs مع LPS و IFNg، IL4، أو IL10. بعد 48 ساعة من العلاج ، غيروا النمط الظاهري ، المشار إليه هنا باسم M (LPS + IFNg) ، M (IL4) ، و M (IL10) ، على التوالي29. تحليل التعبير الجيني هو أداة مفيدة لاختبار حالة الاستقطاب من الضامة. على LPS وIFNg التحفيز، الضامة upregulationed mRNA التعبير عن الجينات CD40، VCAM1، وTNFA (الشكل 5A). على تحفيز IL4، الخلايا upregulationed mRNA التعبير عن الجينات CD68، CD84، وMRC1 (الشكل 5B). على تحفيز IL10 ، iPSC – DMs التعبير المنظم من MRC1 (الشكل 5B). من حيث البلعوم ، أظهرت الضامة التي عولجت مع LPS + IFNg أو IL4 نسبة أقل بكثير من الخلايا البلعومية بالمقارنة مع الضامة الساذجة. iPSC-DMs تعامل مع IL10 أظهرت زيادة نسبة الخلايا البلعومية ومؤشر البلعوم(الشكل 5C-E). الشكل 1: ملخص بياني للتمايز iPSC إلى الضامة الوظيفية الناضجة. رسم تخطيطي مرسوم مع Biorender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: تمايز iPSC نحو الضامة ورقم iPSC-DM وmorphology. (A)صور حقل مشرق تم الحصول عليها من (يسار إلى يمين): مستعمرة IPSC، أجسام جنينية (EBs)، خلايا تعليق حصادها، والضامة الناضجة. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب)صورة من السيتوبانات الضامة ملطخة مع كويك ديف عدة. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. (ج)عدد خلايا التعليق التي يتم جمعها لكل حصاد لكل 6 صفيحة بئر من EBs. مؤامرة يظهر يعني + SEM; (ن = 6 تجارب مستقلة بيولوجيا). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: علامة سطح الخلية الضامة فيالنمط الظاهري. (أ)استراتيجية الجاتينغ لتحليل الضامة المشتقة من iPSC الناضجة. تم مسور الخلايا الحية المفردة، ثم تحليلها للتعبير عن علامات سطح الخلية CD45 و CD93 و 25F9. تم رسم بوابات لعلامات سطح الخلية باستخدام الفلورسينس ناقص واحد (FMO) الضوابط. (ب)مخطط بياني للتدفق التمثيلي للبقع المفردة من عناصر التحكم iPSC-DMs (الأزرق) وisotype (الرمادي) للنسب وعلامات النخاع ، وعلامات التشكيل المناعي ، وعلامات النضج ، ومستقبلات chemokine. المؤامرات هي ممثلة لـ n = 5 تجارب مستقلة بيولوجيالجميع علامات النسب والنخاع، باستثناء CD105 و CD206 (n = 3)؛ علامات النضج (ن = 5)؛ علامات التشكيل المناعي (n = 3)؛ ومستقبلات العلاج الكيميائي (ن = 3). استخدام قطع الأراضي البيانات المنشورةسابقا8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: الاستقطاب IPSC-DM ومقالات البلعوم. صور تمثيلية من iPSC-DMs(A)مباشرة بعد إضافة الخرز الأخضر Zymosan pHrodo و(B)175 دقيقة بعد إضافة الخرز. الأزرق يمثل نواة الخلايا. الأحمر يمثل السيتوبلازم الخلايا. الأخضر يمثل الخرز المنقبل (شريط مقياس = 20 ميكرومتر). (ج)جزء من الضامة البلعوموية و (D)مؤشر البلعوم / كثافة الخضراء لكل الضامة البلعوم مع مرور الوقت في الدولة الساذجة (ن = 6 تجارب مستقلة بيولوجيا). تظهر المؤامرات القيمة الوسطى وتمثل الأشرطة SEM. تستخدم قطع الأراضي البيانات المنشورة مسبقًا8. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تقييم حالات الاستقطاب بين iPSC وDM. القياس الكمي النسبي لتحليلات RT-PCR لـ iPSC-DMs الساذجة والمستقطبة لتقييم التعبير عن (A)M (LPS + IFNА)؛ (ب)M (IL4) و M (IL10) الجينات المرتبطة (ن = 6 تجارب مستقلة بيولوجيا؛ في اتجاه واحد ANOVA وهولم سيداك مقارنات متعددة بعد الاختبار. وقورنت الجماعات المستقطبة إحصائياً بالمجموعة الساذجة فقط. تعرض المخططات القيمة الوسطى، وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. ND في المؤامرات = لم يتم الكشف عن النص. وقد سبق نشر بيانات هذه المؤامرات8. (C)صور تمثيلية لـ iPSC-DMs 175 دقيقة بعد إضافة حبات pHrodo من iPSC-DMs المعالجة (من اليسار إلى اليمين): لا cytokines، LPS +IFN-Y، IL-4، و IL-10 (شريط مقياس = 20 ميكرومتر). (D)جزء من الضامة البلعوموية و (E)مؤشر البلعوم / كثافة الخضراء لكل الضامة البلعوم في العلاجات الضامة الساذجة والمستقطبة 175 دقيقة بعد إضافة الخرز (ن = 12 التجارب المستقلة بيولوجيا، ANOVA في اتجاه واحد وHolm-Sidak في مقارنات متعددة بعد الاختبار. وقورنت الجماعات المستقطبة إحصائياً بالمجموعة الساذجة فقط. تظهر المؤامرات متوسط القيمة وتمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري (* p & 0.05، **p < 0.01، ***p < 0.001، ****p < 0.0001). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

والبروتوكول المتعلق بتوليد الـ iPSC-DMs الموصوف هنا قوي ويسمح بإنتاج عدد كبير من الخلايا المتجانسة من عدد صغير نسبياً من الخلايا المتجانسة. بعد التمايز الأولي لما يقرب من 1 × 106 iPSCs ، يمكن حصاد الثقافات اللاحقة كل 4 أيام لمدة تصل إلى 2-3 أشهر ، مما يؤدي إلى إنتاج ما لا يقل عن 6.5 × 107 الضامة خلال ذلك الوقت. هذه في الضامة البشرية التي تم إنشاؤها في المختبر هي تشبه شكليا ً الضامة البشرية الأولية ، وتعبر عن علامات سطح الخلية الضامة الرئيسية ، وتبدي نشاطًا أبويليًا. بروتوكول التمايز الضامة قابلة للاستنساخ ويمكن تطبيقها على خطوط الخلية hiPSC و hESC الأخرى ، ولكن التوقيت الدقيق للحصاد الأول من سلائف الضامة والأعداد المطلقة للخلايا التي يمكن إنشاؤها يختلف بين خطوط iPSC.

وقد ثبت أن الضامة يمكن توليدها من الـ iPSCs التي تم التلاعب بها وراثيا. على سبيل المثال، تم إدراج شريط transgene يتكون من مراسل الفلورسنت ZsGreen تحت سيطرة مروج CAG التأسيسي في مكان AAVS1 من خط SFCi55 iPSC، وتبين فيما بعد أن هذا الخط iPSC يمكن تمييزه في الضامة التعبير ZsGreen8. ويمكن استخدام هذه الضامة الفلورية في المستقبل لتتبع هجرة واستقرار الضامة العلاجية في نماذج المرض. في دراسة أخرى، تم إنشاء الضامة من خط iPSC التي تم التلاعب بها وراثيا للتعبير عن عامل النسخ الناجم عن تاموكسيفين، KLF1. أدى تفعيل KLF1 في الضامة المشتقة من iPSC إلى إنتاج الضامة ذات النمط الظاهري الذي يماثل الضامة في الجزيرة الحمراء9. يحتمل أن تستخدم هذه الاستراتيجية لبرنامج الكائد المشتقة من iPSC وراثيا ً في الأنماط الظاهرية المرتبطة بمجموعات الضامة الأخرى الخاصة بالأنسجة مثل خلايا Kupffer في الكبد أو خلايا Langerhans في الجلد. سيكون هذا ممكناً بمجرد تحديد عوامل النسخ الرئيسية التي تحدد أنواع الخلايا هذه.

وفيما يتعلق بالبروتوكول، من المهم جداً ملاحظة أن حالة بدء عدد السكان من المراكز المتكاملة للخدمات المدنية أمر بالغ الأهمية لنجاح التمايز. يمكن تجاوز الثقافات iPSC الإنسان مع السكان الفرعيين غير طبيعي karyotypical بشكل غير طبيعي على عدة ممرات، لذلك ينصح بالمعالجة قوية من أسهم iPSC والأسهم الرئيسية دفعة كبيرة تخضع لمراقبة جودة الجينوم. في أيدينا، يمكن أن تحافظ بروتوكولات الصيانة الموصوفة هنا على أجهزة iPSCs العادية بشكل نموذجي لمدة تصل إلى شهرين في الثقافة المستمرة، ولكن هذا قد يختلف لخطوط الخلايا المختلفة وفي مختبرات مختلفة. إذا واجهت مشاكل، فمن المستحسن استخدام قارورة جديدة من iPSCs غير متمايزة لكل تجربة التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي ألا تكون ثقافة البدء في مراكز دعم البرامج المتكاملة غير المتمايزة أكثر من 80 في المائة. في مرحلة الطلاء EB، يجب مطلي فقط 10-15 EBs لكل بئر من لوحة زراعة الأنسجة الآبار 6، ومن الأهمية بمكان أن تنتشر هذه EBs بالتساوي عبر البئر. وكان لعدد أكبر من EBs و / أو تكتل EBs في وسط البئر تأثير سلبي على أعداد الضامة التي تم إنشاؤها. وينبغي توخي الحذر عند تجديد وسائل الإعلام وحصاد خلايا تعليق السلف الشبيهة بالطور الأحادي من ثقافات EB لتجنب إزعاج التصاق EBs بسطح لوحات الثقافة المغلفة. عدد خلايا التعليق الهيماتوبويتيك المنتجة يزيد تدريجيا مع كل محصول، مع الإنتاج الأمثل بين أيام 40-72 من التمايز(الشكل 2). ينخفض الإنتاج تدريجيا بعد اليوم 68 وتميل الصفائح إلى العادم بعد 2.5 أشهر ، على الرغم من أن التوقيت الدقيق يمكن أن يختلف اعتمادًا على خط iPSC.

أحد القيود المفروضة على بروتوكولنا هو أنه لم يكن من الممكن الحفاظ على خلايا التعليق الهيماتوبويتيك التي تم إنشاؤها في نهاية المرحلة 2. البروتوكولات التي تعتمد على التنشيط الخارجي لتقرير WNT حول معدل استرداد 40٪ بعد الحفظ بالتبريد ، ولكن هذه البروتوكولات تبلغ عن حصاد خلية واحدة فقط ، وبالتالي فإن العدد المطلق للالضامة المتولدة منخفض30. البروتوكول الموصوف هنا ، مما يحفز الإشارات الذاتية عن طريق تشكيل EBs ، يمكن حصادها كل أسبوعين ، مما ينتج عائد ًا إجماليًا أعلى بكثير من الضامة.

وباختصار، نقدم بروتوكولا مفصلا لإنتاج الضامة الوظيفية المشتقة من iPSC. إن إجراء تجارب في المختبر مع الأفاج المشتقة من iPSC لدراسة بيولوجيا الضامة في الصحة والمرض له العديد من المزايا على تجارب الضامة المشتقة من الخلايا الأحادية (MDMs). وتشمل هذه المزايا سهولة الوصول إلى المواد (على سبيل المثال، لا حاجة إلى مانحين)، ويمكن إنتاج كميات كبيرة جدا من الضامة، ومن الممكن والمباشر نسبيا إنتاج الضامة المعدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، قد تكون الضامة المشتقة من iPSC موردًا أفضل لدراسة بيولوجيا الضامة المقيمة في الأنسجة.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر فيونا روسي وكلير كرير للمساعدة في قياس الخلايا المتدفقة، إيوغان أودويبهر وبرتراند فيرناي مع المجهر. تم تمويل هذا العمل من قبل CONACYT (M.L.-Y.) ، ويلكوم ترست (102610) وInnovation UK (L.M.F) ، ويلكوم تراست دكتوراه (A.M) ، MRC الطب الدقيق الطالبية (T.V). تم دعم L.C. و J.W.P. من قبل ويلكوم ترست (101067/Z/13/Z)، ومجلس البحوث الطبية (MR/N0222556/1)، وCOST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).

Materials

2-Mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350010
Abtibody CD64-APC -CY7 Biolegend 305026 Dilution factor: 1:100
Antibody 25F9-EFLUOR 660 Ebioscience 15599866 Dilution factor: 1:20
Antibody CCR2-PE-Cy7 Biolegend 357212 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR5 PE Biolegend 313707 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR8 PE Biolegend 360603 Dilution factor: 1:100
Antibody CD11b-PE Biolegend 301305 Dilution factor: 1:50
Antibody CD14-APC Ebioscience 10669167 Dilution factor: 1:20
Antibody CD163-PE-CY7 BIolegend 333614 Dilution factor: 1:25
Antibody CD169-APC Biolegend 346007 Dilution factor: 1:25
Antibody CD206-PE Biolegend 321106 Dilution factor: 1:100
Antibody CD209-PE-CY7 Biolegend 3310114 Dilution factor: 1:100
Antibody CD274-PE-CY7 Biolegend 329718 Dilution factor: 1:100
Antibody CD43-PE Ebioscience 10854419 Dilution factor: 1:100
Antibody CD45-APC Ebioscience 15577936 Dilution factor: 1:20
Antibody CD86-APC Biolegend 305412 Dilution factor: 1:100
Antibody CD93-PE Ebioscience 10804637 Dilution factor: 1:100
Antibody CX3CR1-PE Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antibody HLA-DR-BV650 Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antiboy CD115-PE Biolegend 347308 Dilution factor: 1:40
Cell Dissociation Buffer, enzyme free Thermofisher 13151014
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS Gibco 13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well PerkinElmer 6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain Thermofisher C10046 Cryopreservation media
Cryostor CS10 Sigma C2874
CTS CELLstart Substrate Invitrogen A1014201 Stem cell substrate
DAPI Merck D9542-1MG Final concentration 1 μg/mL
DPBS, calcium, magnesium (500ml) Thermofisher 14040091
FcR Blocking Reagent, human MACS Miltenyi Biotec 130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein Thermofisher PHG0021
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IFNY Thermofisher 14-8319-80
Human Serum Albuminum Irvine Scientific 9988
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli Sigma L2630
NucBlue (Hoechst33342) Thermofisher R37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis Thermofisher P35365
Porcine Skin Gelatin Sigma G9136
Recombinant Human BMP4 Protein R&D 314-BP-010
Recombinant Human IL10 Preprotech 200-10
Recombinant Human IL3 Preprotech 200-03-10
Recombinant Human IL4 Preprotech 200-04
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100ug Biolegend 574806
Recombinant Human VEGF Protein R&D 293-VE-010
Rock Inhibitor Y-27632 Merck SCM075
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein Thermofisher PHC2111
StemPro hESC SFM Thermofisher A1000701
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool Thermofisher 23181010
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface Greiner 657970
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
X-Vivo 15 500 mL bottle Lonza BE02-060F
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  3. Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
  4. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  5. Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
  6. Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
  7. Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
  8. Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
  9. Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881 (2019).
  10. Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
  11. Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
  12. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  14. Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  15. Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
  16. Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
  17. Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
  18. Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56 (2008).
  19. Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
  20. Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
  21. Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
  22. Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , 1-15 (2015).
  23. Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  24. Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
  25. Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  26. Yang, C. -. T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
  27. Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
  28. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
  29. Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  30. Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).

Tags

MacrophagePluripotent Stem CellsCell TherapyGenetic ManipulationCell CultureCell DifferentiationEmbryoid BodiesCell PassagingCell HarvestingMedia Replenishment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Lopez-Yrigoyen, M., May, A., Ventura, T., Taylor, H., Fidanza, A., Cassetta, L., Pollard, J. W., Forrester, L. M. Production and Characterization of Human Macrophages from Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (158), e61038, doi:10.3791/61038 (2020).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image