Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

1. C. 예인자의 유지 보수 및 동기화 OP50 에슈리치아 대장균 균으로 시드된 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 20°C의 벌레를 유지하여 여러 성인을 주10주에약 2배씩 신선한 접시로 이송한다. 이 그들의 생리학에 영향을 미칠 수 있기 때문에 음식이 부족에서 벌레를 방지하기 위해 주의해야한다11. NGM 플레이트준비. NaCl 3 g, 바토 펩톤 2.5g, 한천 20g, 탈이온화(DI) H2O 최대 1L를 플라스크에 섞는다. 멸균을 위한 혼합물을 자동 클로브합니다. 혼합물을 ~50°C로 식힙니다. 1M KH2PO4 (pH = 6) 1 mL 의 25 mL을 추가, 1 M CaCl2의1 mL, 1 M MgSO4의1 mL, 콜레스테롤 1 mL (100 % 에탄올에서 5 mg / mL). 멸균 기술을 사용하여 혼합물을 6cm 플레이트에 부어 약 100 플레이트를 산출합니다. 혼합물이 먼저 300mL 멸균 비커로 전달되면 플레이트를 붓는 것이 더 쉽습니다. 박테리아로 파종하거나 4°C에서 저장하기 전에 실온(RT)에서 고형화할 수 있도록 1일을 허용하십시오. NGM 플레이트에 OP50 박테리아의 파종. 30°C 또는 37°C에서 LB에서 포화 하룻밤 OP50 세균 배양을 성장시다. 배양의 약 300 μL을 NGM 플레이트의 중앙에 놓습니다. 세균 잔디가 접시에 부착하는 데 필요한 대로 1-3 일 동안 RT에서 접시를 건조시키십시오. 그런 다음 플레이트를 4°C에서 사용하거나 저장할 수 있습니다. 새로 낳은 계란(여기에 설명된)을 분리하거나 표백제로 벌레를 용해한 후 계란을 수집하여 벌레를 동기적으로 성장시키세요. 약 10개의 그레이드 성인용 웜을 백금 와이어 픽을 사용하여 신선한 접시에 옮기십시오. 어른이 성인의 첫날에 있는 경우에 계란 평신도 동기화는 가장 잘 작동합니다. 약 1 시간 후에 플레이트에서 웜을 제거합니다. 이 조건 및 변형에 따라 접시 당 40-60 계란 귀착되 야 한다. 2. HSR 기자의 형광 화상 진찰 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. AM446(hsp-70p:gfp)과CL2070(hsp-16.2p::gfp)의경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레가 달걀 누워 동기화 후 64h를 생성한다.참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 두 HSR 리포터 균주는 N2에 비해 약간의 발달 지연을 나타낸다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 순환 하는 수조에 1 h를 대 고 침수 하 여 벌레를 열 충격. 파라핀 필름의 얇은 스트립은 가장자리를 밀봉하기 위해 접시 주위에 2 배 포장해야합니다. 플레이트의 바닥을 덮지 않거나 열 전달을 방해할 수 있습니다. 테스트 튜브 랙과 리드 무게를 사용하여 플레이트를 거꾸로 잠급합니다. 필요한 경우 음수 제어 샘플(열 쇼크 없음)을 포함해야 합니다.참고: 파라핀 필름이 안전하지 않으면 물이 플레이트에 들어가면 플레이트를 데이터 수집에 사용해서는 안 됩니다. 수조에서 접시를 제거하고 종이 타월로 건조하여 벌레를 복구합니다. 파라핀 필름을 제거하고 6-24h동안 20°C에서 웜을 배양한다. 이 복구 기간은 이미징 전에 GFP 합성 및 접기에 충분한 시간을 허용합니다. 이미징을 위한 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드는 사용마다 신선하게 준비해야 합니다. 아가로즈가 용해될 때까지 전자레인지를 사용하여 물과 열로 3% 아가로즈 용액을 만듭니다. 아가로즈 패드용 스페이서를 만들기 위해 실험실 테이프 스트립이 있는 두 개의 다른 현미경 슬라이드 사이에 이미징을 위한 현미경 슬라이드를 배치합니다. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 가열된 3% 아가로즈의 드롭(~150 μL)을 현미경 슬라이드의 중앙에 놓습니다. 상단 슬라이드가 인접한 슬라이드의 실험실 테이프에 놓이도록 첫 번째 슬라이드에 수직으로 빈 현미경 슬라이드로 현미경 슬라이드를 즉시 덮습니다. 이것은 균일 한 폭의 패드를 만들기 위해 아가로즈의 방울을 확산. 조심스럽게 상단 슬라이드를 제거합니다. 200 μL 파이펫을 사용하여 M9 버퍼에 1mM 레바미솔의 작은 낙하(~5 μL)를 아가로즈 패드의 중앙에 추가하여 웜을 고정합니다. 그런 다음 백금 와이어 픽을 사용하여 10 개의 웜을 레바미솔 드롭으로 옮길 수 있습니다. 커버 슬립으로 덮습니다. 덮개 전표를 밀봉하는 것은 직립 현미경을 위해 필요하지 않습니다. 선택적으로, 벌레는 레바미솔을 벗겨내고, 아가로즈 패드의 바깥쪽으로 퍼지고, 벌레를 백금 와이어 픽으로 정렬하여 마비될 때 정렬될 수 있다. 또는, 레바미솔은 실험실 닦아를 사용하여 담글 수 있습니다.참고: 레바미솔의 장기간 잠복이 형광을 바꿀 수 있기 때문에 가능한 한 빨리 이미지. 형광 현미경을 사용하여 웜을 이미지합니다. 이미지 캡처의 세부 사항은 현미경 과 소프트웨어에 따라 다릅니다.참고: 이미지 강도를 직접 비교하려면 한 이미징 세션에서 동일한 현미경 설정을 사용합니다. 이미지를 과도하게 사용하지 마십시오. 3. RT-qPCR을 이용한 HSR 유전자 발현 측정 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). 단계 2.2에 설명된 열 충격 벌레. 수조에서 접시를 꺼내 파라핀 필름을 제거하고 즉시 벌레를 수집합니다. 벌레는 M9의 1mL로 부드럽게 판을 세척하고, 마이크로 원심 분리기 튜브에서 액체를 수집한 다음, 원심 분리 후 M9을 1 분 동안 400 x g에서 제거하여 수집 할 수 있습니다. 벌레를 lyse하고 유기 추출을 사용하여 RNA를 정화합니다. RNA 격리 시약250μL를 추가합니다(재료표참조). 30 초 동안 손으로 소용돌이 튜브. 마이크로센트심분리기 튜브 부착물을 사용하여 4°C에서 20분 동안 소용돌이 튜브(재료 표참조). 50 μL의 클로로폼을 추가합니다. 30 초 용 소용돌이. 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양. 4°C에서 15분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기. 수성 층(즉, 위층, ~125 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오. 50 μL의 클로로폼을 추가합니다. 30 초 용 소용돌이. 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양. 4°C에서 5분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기. 수성 층(~100 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오. 이소프로판올의 동일한 부피(즉, 100 μL)를 가진 RNA를 침전시한다. 적어도 30 분 동안 -20 °C에서 배양하지만 바람직하게는 하룻밤.참고: 실험은 여기서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C에서 저장될 수 있다. 4°C에서 ≥30 분동안 ≥14,000 x g에서 원심분리로 RNA를 펠렛. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.참고: 펠릿이 작아 보이지 않을 수 있습니다. 펠릿은 튜브의 측면에 단단히 부착되지 않을 수 있으므로 불고있는 것을 피하기 위해주의가 필요합니다. RNase 프리 H2O로 만든 70 % 얼음 차가운 에탄올의 250 μL로 펠릿을 씻으십시오. 4°C에서 ≥5 분동안 ≥14,000 x g의 원심분리기. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오. RT에서 빠른 스핀을 수행하여 나머지 70%의 에탄올을 제거합니다. 필요에 따라 RT에서 튜브를 열어 두어 펠릿을 건조시키십시오. 일반적으로 적어도 20 분. 튜브는 오염을 방지하기 위해 보풀이없는 조직 또는 알루미늄 호일로 덮여 있을 수 있습니다. RNase 프리 H2O의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다. 소량 분광광계(2 μL)를 사용하여 RNA 농도를 결정한다.참고: 실험은 여기에서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C 이하에서 일시적으로 저장될 수 있다. DNase I로 배양하여 잔류 DNA를 제거합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다. 이 키트를 사용하면 37°C 수조에서 RNA 500 ng 및 DNase I의 1 μL로 20 μL 반응을 30분 동안 준비합니다. 각 샘플에 DNase 비활성화 시약(키트에 포함)의 2.5μL을 추가하고 RT에서 5분 동안 비큐어를 가끔 깜박임/소용돌이로 배양합니다. 2 분 동안 14,000 x g에서 아래로 회전합니다. 흰색 펠릿을 방해하지 않고, cDNA 합성을 위한 신선한 마이크로튜브로 15 μL의 체퍼를 옮기. cDNA 합성을 실시합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다. 키트를 사용하면, 이전 단계에서 DNase I 처리 RNA의 15 μL 및 역 전사의 1 μL로 20 μL 반응을 준비한다. cDNA 합성을 위해 다음 프로그램을 사용하십시오: 5분 동안 25°C, 20분 동안 46°C, 1분 동안 95°C, 4°C 홀드. 샘플에 직접 RNase 가없는 H2O의 80 μL을 추가하여 cDNA를 희석시 희석시. 잠시 소용돌이를 한 다음 회전하여 필요할 때까지 -20 °C에 보관하십시오. qPCR을 수행합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다. 키트를 사용하면 2μL의 cDNA 와 200nM(각)의 전방 및 역 프라이머를 96웰 플레이트의 한 웰에 포함하는 25 μL 반응을 준비합니다. 열 충격 유전자, hsp-70 및 hsp-16.2및 18S rRNA(정규화 제어를 위한)를 측정하기 위한 프라이머 서열이 재료표에나열된다. 여러 정규화 컨트롤을 원하는 대로 사용할 수 있습니다. 분석이 선형 범위에 있는지 확인하기 위해 18S의 측정 전에 cDNA 샘플을 50배 희석합니다. 적절한 qPCR 조건은 사용되는 키트 및 프라이머에 따라 다릅니다(대표 결과 참조). 5s 데니션용 95°C의 40사이클, 30s 어닐링용 58°C, 30s 확장을 위한 72°C의 qPCR용 실시간 PCR 검출 시스템(재료 표참조)을 사용한다.참고: 최적의 어닐링 온도는 프라이머와 조건에 따라 다를 수 있습니다. ΔΔCt 또는 표준 곡선방법(12)을사용하여 정량화한다. 4. 유기 수준에서 HSR을 측정하기위한 열회수 분석 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조). 6h에 대해 2.2 단계에서 설명된 바와 같이 벌레를 열 충격. 수조에서 플레이트를 제거하고 파라핀 필름을 제거하고 웜이 48h에 대해 20°C에서 20°C에서 배양하여 회수할 수 있도록 합니다. 육포 운동이나 마비없이 기계적 자극 후 즉시 기어 갈 수있는 웜의 수를 계산합니다.참고: 6h 인큐베이션은 열회수를 줄이는 조건을 검사하는 데 최적이지만 열회수를 향상시키는 조건을 찾기 위해 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다.