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Comportamento

使用功能学习腿分割和跟踪 （FLLIT） 在自由移动昆虫中实现全自动腿部跟踪

Published: April 23, 2020
doi:
10.3791/61012
, , ,
1Institute of Molecular and Cell Biology,Agency for Science, Technology and Research, 2Bioinformatics Institute,Agency for Science, Technology and Research, 3Department of Electrical and Computer Engineering,University of Alberta

Summary

我们描述了使用FLLIT的详细协议，FLLIT是一种全自动机器学习方法，用于在自由移动的果蝇黑色素气器和其他昆虫中跟踪腿爪运动。这些协议可用于定量测量野生苍蝇、突变苍蝇和神经退化的苍蝇模型的细微行走步态运动。

Abstract

果蝇模型对于神经功能的研究和理解神经退化的分子和细胞机制是无价的。虽然用于操纵和研究神经元子集的飞行技术已经变得越来越复杂，但由此产生的行为表型的丰富性并没有在类似的细节中被捕获。要能够研究细微的飞腿运动，以便突变体之间的比较，需要自动测量和量化高速和快速腿部运动的能力。因此，我们开发了一种机器学习算法，用于在自由行走的苍蝇、基于功能学习的肢体分割和跟踪 （FLLIT） 中实现自动腿爪跟踪。与大多数深度学习方法不同，FLLIT 完全自动化，无需用户注释即可生成自己的训练集，使用学习算法中内置的形态参数。本文介绍了使用FLLIT进行步态分析的深入协议。它详细介绍了摄像机设置、竞技场建设、视频录制、腿部分割和腿部爪跟踪的过程。它还概述了FLLIT生成的数据，其中包括每个视频帧的原始跟踪身体和腿部位置、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频。为了证明FLLIT的使用，我们在脊柱生成药物aa 3的飞行模型中量化了相关的病变步态参数。

Introduction

在过去的几十年里，神经退行性疾病和运动障碍在我们的老龄化人群中越来越普遍。尽管我们对许多神经退行性疾病的理解在分子和细胞水平上有所进步，但受影响的神经元回路基础疾病的基本特征仍然知之甚少。最近开发的行为跟踪工具1,1，2，3，4现在允许我们研究运动异常的动物疾病模型，以识别分子，细胞和电路调节基础疾病。2,3,4

许多神经退行性疾病的分子通路在果蝇果蝇果蝇黑色素加斯特中得到保存，果蝇病模型有助于阐明神经退化5、66的基本机制。5我们最近显示，帕金森病（PD）和脊柱细胞酸藻3（SCA3）的飞行模型表现出独特的、保守的步态特征，类似于人类疾病1，表明苍蝇模型可以用来理解特定运动障碍中运动功能障碍的回路机制。在飞行模型中，在单个基因和单个细胞级别77、8、9、108,9,10中，用于靶向操作和可视化神经元的丰富且不断发展的工具库，使苍蝇成为探索体内疾病通路、神经元回路和行为表型表现之间关系的理想模型之一。为了实现精确的、自动化的昆虫步态分析，我们最近开发了一种机器学习方法，即基于FEature L的LImb分段和T机架（FLLIT）1。1

FLLIT 由一个完全自动化的多阶段算法组成，该算法首先对腿部像素进行段段段，随后用于定位和跟踪相应的腿爪。FLLIT 采用用于分段的增强算法，与最近工作2、,3中使用的深度学习算法相比。在这两个框架中，特征提取通过学习卷积内核自动完成，与卷积神经网络有一些相似之处。FLLIT 的第一步涉及使用形态学操作（边缘和骨架化）以高置信度自动生成正（腿部上的像素）和负数（飞行体上的背景或像素）训练样本。因此，FLLIT 是完全自动化的，不需要用户带带名的培训样本。使用上述训练示例，然后在增强算法的框架内训练分类器。一组弱分类器被迭代地学习，每个分类器包括一组用于特征提取的卷积内核和一个决策树。最后学习的分类器随后用于腿部分割，能够比形态学操作更好地识别困难区域/硬样本，从而生成整体更准确的分割，用于跟踪1。从分段的支腿中，我们找到提示并使用匈牙利算法跟踪它们：通过跨帧匹配提示，从而最小化每个提示移动的距离之和。FLLIT 可以通过记住最后一个看到的位置（以苍蝇中心坐标）来处理阻塞情况，以便在腿尖不再被遮挡时恢复。

我们之前表明，FLLIT可以自动和准确地跟踪腿部运动，并分析步态在一个无标记，自由移动的苍蝇或蜘蛛从高速视频1;因此，FLLIT应广泛适用于节肢动物腿跟踪。通过利用形态参数提取机器学习训练套件，FLLIT 自动训练自己对昆虫腿进行分割和跟踪，而无需费力的手动注释，这是大多数深度学习方法所必需的。因此，FLLIT 是完全自动化的。在腿部分割和跟踪后，FLLIT 可自动在每个视频帧中生成原始跟踪的身体和腿部位置、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频，用于步态分析和步态运动的可视化。该协议提供了使用 FLLIT 的分步指南。

Protocol

1. 系统设置 确保录音台有一个高速摄像头和一个舞台，以容纳竞技场室（图1）。调整相机以每秒 250 帧 （fps） 的速度进行录制，快门速度相应快（在这种情况下，以 1000 fps 的速度进行录制，快门速度为 1 毫秒）。注： 通过确保所有帧中移动支腿的最小或没有运动模糊，检查视频是否适合跟踪。如果移动支腿模糊以至于人类的托玛无法跟踪，则必须提高摄像机记录速度和/或快门速度。 将红外 LED 灯放在舞台顶部，在摄像机和样品之间使用扩散器（半透明板）（图 1A，B）。 通过切割 1.6 mm 厚的丙烯酸板制作记录室。在本实验中，使用 11 mm x 11 mm 的视场。将腔室放在两个玻璃幻灯片之间（图 1C）。 2. 准备飞行记录 在记录前24小时将要记录的苍蝇转移到新的食物瓶中。注：在录制前，请勿在苍蝇上使用 CO2（通常用于在第一次采集时麻醉苍蝇）。 在录音前约40分钟，将苍蝇转移到空小瓶中，在冰上保持5-7分钟。 同时，用清水和擦拭擦拭竞技场和透明玻璃滑梯。注：请勿使用乙醇清洁腔室和滑轨。 准备录音室。用胶带固定造型室下方的一个微型玻璃滑梯。 当苍蝇在冰上麻醉时，用干净的刷子在每个腔室中转移一只苍蝇。注：雄性苍蝇和雌性苍蝇都可以用于此设置，并且，应尽可能分析男女苍蝇，以避免性别特定的偏见。 用胶带将另一张微型玻璃滑板固定（图 1C）。 将室室苍蝇保持在室温下 15 – 20 分钟，以便适应。 3. 生成 FLLIT 分析视频 注： 此步骤特定于所使用的摄像机。在这种情况下，使用商用摄像机（参见材料表）。 打开电源。等待绿色 LED 通电，等待橙色 LED 的以太网接口连接稳定。打开红外 LED 的电源。确保电压保持在 12.5 V。 在连接的计算机系统上打开查看器应用程序。 将录制帧速率更改为 1000 fps。将快门速度设置为 1/1000 s （1 毫秒）。 将带苍蝇的造型室放在录制舞台上，然后选择”实时”按钮。当苍蝇直立在造型室的地板上时，确保相机聚焦在腿部尖端上;腿尖应该是尖锐的焦点。 单击”记录”（图 2）。 记录苍蝇行走，确保：苍蝇在一条相对笔直的轨道上行走，没有触及竞技场的边缘。苍蝇每条腿至少走了三步。苍蝇在行走过程中不会暂停。走的距离相当于至少一个身体长度。注： 干净地减去背景对于精确分割至关重要。FLLIT 采用的自动背景减法算法要求成像苍蝇在距离上移动至少一个身体长度。 单击”完成”以停止录制 （图 2）。 裁剪视频以确保录制仅包含苍蝇的直行（如步骤 3.6 中所述）。 单击”保存”（图 2）。将文件以”.mraw”或”.tiff”格式保存在相应的文件夹中。注： 与”.tiff”文件格式相比，”.mraw”格式提供了更大的灵活性来更改文件名（如果需要）和存储视频。 4. 安装FLLIT程序 注： 最新的说明可在以下处找到：https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/blob/master/Compiled/Readme.pdf 在任何操作系统上下载 FLLIT 从以下 Github 链接下载 FLLIT：https://github.com/BII-wushuang/FLLIT/archive/master.zip。提取 zip 文件的内容。 从以下 Google 云端硬盘链接下载示例数据集：https://bit.ly/2EibvNY。在 FLLIT 主/编译下创建文件夹数据，并将数据集文件夹放在此数据目录中。 在乌本图安装 FLLIT 导航到 FLLIT/已编译目录。 右键单击并选择”在 Terminal 中打开”。 发出以下命令以下载并安装 MATLAB 运行时库以$HOME/MCR：bash MCR_2016a.sh 完成 MATLAB 运行时库的安装后，发出以下命令以确保将可执行权限授予 FLLIT：chmod #x FLLIT 打开 FLLIT/编译目录中的终端并发出以下命令以执行 FLLIT：bash run_FLLIT.sh $HOME/MCR/v901 在 Windows 中安装 FLLIT 对于第 7 版和第 10 版，请安装 Docker 工具箱：：（https://github.com/docker/toolbox/releases/download/v19.03.1/DockerToolbox-19.03.1.exe）。 对于 Windows 10 专业版或企业版，请安装适用于 Windows 的 Docker 桌面：（https：//下载.docker.com/win/win/稳定/Docker_Desktop_安装程序.exe）。 要在 Windows 上的 Docker 容器中启用 GUI 应用程序执行，请先安装 VcXSrV （https://sourceforge.net/projects/vcxsrv）。在启动 VcXsrv 时，请按照图 S1中所示配置设置。注： 在开始 FLLIT 之前，请确保 Docker 和 VcXsrv 正在运行。 双击 FLLIT.bat 以运行 FLLIT。注： 首次执行时，需要一些时间才能从 Docker 集线器中提取 Docker 映像。 在 MacOS 中安装 FLLIT 下载 Docker 桌面，以https://download.docker.com/mac/stable/Docker.dmg 通过打开终端并发出以下命令来安装索卡特：酿造安装索卡特 开始使用：socat TCP-LISTEN：6000，重用添加器，分叉 UNIX-CLIENT：”$DISPLAY”和”否认” 安装 XQuartz （https://www.xquartz.org）以便在 MacOS 上的 Docker 容器中执行 GUI 应用程序。启动 XQuartz 并通过选中”安全”选项卡中的”允许来自网络客户端的连接”来更改首选项，如图 S2所示。注： 在开始 FLLIT 之前，请确保 Docker、socat 和 XQuartz 都在运行。 打开 FLLIT/编译目录中的终端，并执行 FLLIT，并具有以下命令：bash FLLIT_Mac.sh注： 首次执行时，需要一些时间才能从 Docker 集线器中提取 Docker 映像。 5. 运行 FLLIT 进行自动腿部跟踪 分割 将视频转换为单独的 TIFF 文件并复制到 FLLIT 数据文件夹中。 运行 FLLIT（在 Ubuntu 中，右键单击以在终端中打开 FLLIT）。 选择包含要跟踪的视频的逐帧 TIFF 图像的文件夹，然后单击”添加”按钮。 在弹出窗口中，选择0进行仅进行腿部分割，或选择 1表示包含带腿部分割的腿跟踪。 单击”完成”以启动所选视频的分段和跟踪。 跟踪 要检查跟踪和进行纠错的准确性（如果有），请单击”选择数据文件夹”。选择要跟踪的文件夹，然后单击”打开”。 单击”查看跟踪”。注：查看跟踪的腿部位置时，检查查看器模式保持选中状态。否则，以前所做的任何更正都将过用。 检查第一帧中所有支腿的标签注：由于腿标签是根据屏幕上的位置放置的，如果苍蝇直立行走，苍蝇的右侧分别标记为L1（前腿）、L2（中腿）、L3（后腿）和苍蝇的LEFT侧，分别标记为R1（前腿）、R2（中腿）、R3（后腿）。如果苍蝇是向上行走的，则腿标签上倒将正确标注。 如果腿部标记错误且需要更正，请单击”暂停查看”，然后单击”调整预测”（图3）。 从右面板头腿调整，选择需要修正的腿。 双击图像窗口中此支腿的正确位置，单击”保存”，然后退出。要转到上一帧或后续帧，请单击”暂停查看”，然后分别单击前进和后退<I和I>按钮（图 3）。 要更正任何错误跟踪的视频，请打开要重新跟踪的视频的数据文件夹，然后选择”手动启动跟踪”。 单击”跟踪”按钮，该按钮将其标签更改为”初始”。 单击”调整预测”，通过双击每个腿尖并更正腿部标签，然后使用正确的腿部标签分配。单击”保存”和”退出”。 单击”恢复”以启动跟踪。 数据处理和视频生成 单击数据进程。在弹出窗口中，键入录制视频的每秒帧数 （fps）（例如，1，000 fps）。 使用以下公式计算捕获视频的实际视场，以便以毫米为单位测量步态参数：注： 例如，如果实际造型室大小为 7 mm，图像框的宽度为 137 mm，计算机屏幕上图像帧中的室的宽度为 81 mm，视野的宽度为 11.83 mm（图 S3）。 要查看跟踪结果，请访问”结果”文件夹下的”跟踪”文件夹。 要生成跟踪苍蝇的视频，请选择”制作视频”。视频将保存在与分析的原始视频数据相同的结果文件夹中。注： 可以选择视频的开始（第一个）和结束（最后）帧。 标准化到每只苍蝇的身体长度。注：由于每只苍蝇的大小可能略有不同，因此某些步态参数应归化为每只苍蝇的体长，以便进行比较（例如，较大的苍蝇的步长可能更长，在较小的苍蝇中较短）。 使用图像软件，从每飞的视频（通常是第一帧、中间帧和最后一帧）打开三个静止图像。 将每个图像帧放大到 800%，并使用明亮的颜色（例如黄色）在中线标记头部前最前像素和腹部最后部像素。 打开 ImageJ 中标记的图像。 使用”设置比例”相应地输入比例：以像素为单位设置距离：512;已知距离：步骤 5.3.2 测量的实际视场 （mm）;长度单位：毫米。 在标记的头部和腹部尖端像素之间绘制一条直线，以获得身体长度。 再次打开”设置缩放”以在已知距离（即以 mm 为单位）获取值。 以三个图像中每个图像中确定的长度平均值为例，以获得以毫米为单位的平均身体大小。

Representative Results

在腿部分割、跟踪和数据处理之后，FLLIT 自动生成身体和每个支腿爪位置的原始数据、20 个步态参数、5 个绘图和一个跟踪视频（表 1）。 在这里，我们使用脊柱小肾上腺素aa 3 （SCA3） 的飞行模型来演示这些分析。泛神经驱动Elav-GAL4用于驱动全长野生型人类SCA3与27谷氨酰胺在多Q道（UAS-SCA3-flQ27），或全长突变人类SCA3与84谷氨酰胺在多Q带（UAS-SCA3-flQ84）11。11SCA3是典型的一个税步态与身体旋转，不稳定的脚放置和短，蹒跚的步骤12，13（表2）。12,为了描述突变SCA3苍蝇的步态特征，并研究它们是否表现出与人类患者相似的步态，我们分析了FLLIT产生的相关步态参数，即：身体转弯次数、脚印规律性、腿部区域重叠和尺寸以及腿部步长（表2）。 我们发现，SCA3-Q84苍蝇表现出更多的转弯（图4A，A’），不稳定的脚放置，如低足迹规律性（扩大标准差的AEP14）（图4B），增加的腿域重叠（图4C-D），C-D扩大腿域的长度和面积（图4E，F），和减少步幅长度（图4G）。 FLLIT 还生成一个视频，显示以竞技场为中心和以身体为中心的视图、身体轨迹和方向以及每条腿的垂直和横向位移的跟踪苍蝇和腿（图 5）。跟踪的视频允许并排比较不同苍蝇腿部运动。Elav-GAL4>SCA3-flQ27 （视频 1） 和Elav-GAL4&gt4 >SCA3-flQ84 （视频 2） 苍蝇的代表性视频表明，与Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27苍蝇 （图 5A）Figure 5B相比， 交叉不同大小的腿部域，表示一个蹒跚、有计划步态的步态。 图 1.设置录音台和竞技场。从 （A） 正面和 （B） 侧视图的录音。（C） 用于制作飞行记录以进行 FLLIT 跟踪的竞技场示例。请点击此处查看此图形的较大版本。 图 2：使用双头摄像头在飞行步态录制期间查看活动窗口，允许同时录制两个苍蝇。请点击此处查看此图形的较大版本。 图 3：在分段和跟踪后显示按钮面板和标记腿的主动 FLLIT 窗口。请点击此处查看此图形的较大版本。 图4：代表FLLIT生成的数据，用于表达野生型（SCA3-flQ27）与突变体（SCA3-flQ84）SCA3（A）体轨迹中旋转次数的A苍蝇的相关步态参数。（B） 中腿脚印规律性正常化到身体长度。（C-C’）遍历每条腿的腿域。（D） 腿之间的域重叠。（E） 中腿域长度与身体长度规范化。（F） 中腿域区域规范化为车身长度2。（G） 中腿步长与体长一般化。请点击此处查看此图形的较大版本。 图 5：具有代表性的 FLLIT 生成的视频的快照。（A） Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27和 （B） Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84 苍蝇.请点击这里查看此图的较大版本。 视频1：代表视频表达泛神经野生型人类全长SCA3（Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ27）。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。 视频2：代表视频表示泛神经突变人类全长SCA3（Elav-GAL4>UAS-SCA3-flQ84）。请点击此处查看此视频。（右键单击以下载。 补充图 1：VcXSrv 的配置。请点击此处查看此图形的较大版本。 补充图 2：Xquartz 的配置。请点击此处查看此图形的较大版本。 补充图 3：标有计算视场所需尺寸的图像。请点击此处查看此图形的较大版本。 类别 参数 描述 文件/打印（如果适用） 原始数据 车身位置 每个帧中身体质质的位置坐标 CoM.csv 的前两列 身体轨迹 车身轴的旋转角度（以度表示）（相对于 y 轴） CoM.csv 的第三列 以竞技场为中心的腿爪位置 基于竞技场坐标，每个帧中每个支腿爪的位置坐标 轨迹.csv 以身体为中心的腿爪位置 每个帧中每个支腿爪的位置坐标基于竞技场坐标 norm_trajectory.csv 身体运动 车身长度（毫米） 每帧估计的样本动物的长度（头部至后部前最位置机翼上的位置） 身体长度.csv 瞬时身体速度（毫米/s） 样本动物体内的瞬时速度（质心） 身体速度.csv;身体速度.pdf 身体的转折点轨迹 要定位转折点，使用 Dougl asPeucker 将轨迹简化为分段线性曲线算法，其后，车削事件被确定为涉及两个相邻之间的角度 > 50 deg构成简化轨迹的线性段 身体轨迹.pdf 单个步幅参数 步长持续时间（毫秒） 步长事件的持续时间 步幅参数.csv 步长周期（毫秒） 从一个步长事件到下一个步长事件的持续时间 步幅位移（毫米） 步幅事件期间腿爪的位移 覆盖的步幅路径（毫米） 步幅活动期间腿爪覆盖的总路径 前极端位置（毫米） 步幅事件结束时腿爪的着陆位置（相对于身体） 后极位置 （毫米） 步幅事件开始时腿爪的起飞位置（相对于身体） 步幅振幅（毫米） 沿步幅事件的运动方向的位移 姿态线性度（毫米） 定义为步幅路径与平滑的曲线的偏差（以 20 毫秒的间隔）平滑到相应的前和后极端位置的步幅 步幅拉伸（毫米） 在步幅事件中间，腿爪位置与车身中心的距离 腿运动 腿速（毫米/s） 每条腿的瞬时速度 腿速度.csv;盖特.pdf 盖特指数 这测量了（六条腿）样本动物在运动过程中表现出的步态协调的类型。步态索引 1 对应于三脚架步态，#1对应于四足步态，而 0 表示非规范步态。在我们的实施中，步态指数是通过 120 ms 窗口上的移动平均线获得的 盖特指数.csv;盖特指数.pdf 移动百分比 腿部运动时间的百分比 腿参数.csv 平均步长周期（毫秒） 从一个步长事件到下一个步长事件的平均持续时间 腿参数.csv 占地面积规律性（毫米） 测量为后发和 腿参数.csv 腿部前极端位置 腿轨迹域区域（毫米2） 在以身体为中心的参照系中包含整个腿轨迹的最小凸体船体区域 腿参数.csv;LegDomain.pdf 的长度和宽度腿轨迹域（毫米） 通过爪位置的最大投影距离获得到主（域长度）和次要（域宽度）主轴 腿参数.csv 腿域交点/重叠（毫米2） 每个可能之间的交点/重叠 勒格内斯重叠.csv 姿态宽度（毫米） 左腿和中腿的 AEP 和 PEP 之间的距离平均值 斯坦茨·斯韦 表1：FLLIT生成的盖特参数。 盖特功能 脊柱小脑的盖特特征 3 （SCA3） 转向 不稳定的脚部和腿交叉 蹒跚的步骤 短步 测量参数 正文转弯事件数 足迹规律性 腿域的大小，域重叠程度 步长 FLLIT 文件 身体轨迹.pdf 腿参数.csv 勒格内斯重叠.csv 步幅参数.csv 表 2：表显示人类患者具有相应 FLLIT 参数和输出文件的标志 SCA3 步态特征。

Discussion

在本手稿中，我们详细描述了使用FLLIT（一个自动机器学习程序1）来分析自由行走的步态的步骤。跟踪和数据分析后，FLLIT 自动生成身体和腿爪位置信息的原始数据，生成 20 个身体和步态特征以及跟踪苍蝇的视频，以实现步态可视化。

现在有一些方法，以腿部运动跟踪果蝇和其他动物121，2，3，4，14，15，16，给研究人员广泛的选择，根据实验的目标。,,3,4,14,15,16其中一些是基于脚印的方法，这是高度准确，但报告只有爪接触点与检测表面4,4，14。另一方面，最近的深度学习方法2、,3、,16是高度通用的，允许分析任何动物中需要跟踪腿部关节和其他身体部位的行为，并需要注意的是，算法需要首先使用用户批带的数据集进行训练。第三种方法使用形态或图像对比度方法11、15、1715,17来查找每个支腿的轮廓来识别爪位置。通常，这些方法对腿交叉的行为处理得不好（例如，在梳理过程中）。FLLIT 结合了第二种和第三种方法，使用形态参数来训练腿部分割的增压算法。这使得 FLLIT 能够绕过用户注释的艰巨任务来生成训练数据集，同时使用机器学习提高准确性。将来对FLLIT的改进将不得不处理腿交叉的实例，以便分析更复杂的行为。

FLLIT 在照明、录制分辨率和帧速度1方面具有细微变化。但是，录制的视频的帧速度不应低于 250 fps，FLLIT 可针对以 1000 fps 录制的视频以最佳方式运行。如果图像中有运动模糊，因此人类说明人难以识别腿部位置，FLLIT 将无法准确识别这些帧中的腿尖。鉴于此，相机必须大幅对准腿部尖端。为了防止分段伪影，应彻底清理竞技场，并且不应在录制过程中移动。为了获得准确的背景减法和干净的分割，苍蝇应在录制过程中至少移动一个车身长度，而不暂停。在自动分割和跟踪所有支腿的标签后，必须检查。如果未错误地跟踪或跟踪飞行步态，则应使用“手动启动跟踪“选项（步骤 5.2.7 = 5.2.10）手动重新跟踪文件。

神经退行性疾病和运动障碍在我们的老龄化社会中越来越普遍。神经退化的飞行模型已经研究了20多年，在此期间，在疾病病理生理学的分子和细胞方面取得了进步。然而，疾病的具体行为后果在技术上是难以评估的。例如，虽然关于苍蝇颤抖运动的报告已经18、19，,19但直到最近1日才定量研究。攀登测定是一个有用和定量的，但相对粗糙的量度6。这种技术缺陷同样阻碍了其他动物模型中的高分辨率运动分析。因此，新的行为分析工具的出现有望恢复运动障碍领域，使研究人员能够研究神经肌肉疾病的分子和细胞机制如何导致动物模型中的特定行为结果。在本文中和我们以前的工作1中，我们展示了使用FLLIT，SCA3的飞行模型表现出超动力学的有计划步态，而PD飞行模型表现出低动性刚性步态，重述了各自人类疾病1的运动特征。盖特分析还使我们能够识别特定运动功能障碍背后的不同神经元种群。展望未来，详细的运动分析，结合飞行中强大的成像和功能工具，将使我们能够获得对LOcomotor功能障碍机制的新见解，照亮我们对神经退行性疾病与电路机制的理解。

FLLIT应广泛适用于研究其他小节肢动物的步态，因为它以前被证明是高度精确的跟踪蜘蛛腿运动1。虽然我们在这里专注于使用详细的运动现象来量化致病步态及其基础电路，但运动跟踪的进步已经彻底改变，并将对正常行走协调和步态及其基础电路的理解产生持续的影响，特别是在进化树的无数不同分支中。

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢穆米塔·查特吉和爱丽丝·刘的技术支持，以及布卢明顿果蝇股票中心（美国印第安纳州）提供本作品中使用的果蝇菌株。这项工作得到了新加坡分子和细胞生物学研究所的支持;新加坡生物信息学研究所;科学技术和研究局联合理事会组织（授予SA和LC编号15302FG149）;由新加坡卫生部国家医学研究委员会（授予编号NMRC/TCR/013-NNI/2014至SA）、阿尔伯塔大学（对LC的启动赠款）和加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）发现补助金（授予编号RGPIN-2019-04575给LC）管理的临床研究旗舰计划（帕金森病）。

Materials

Acrylic Sheets Dama 1.6 mm thickness, Clear sheets Singapore, Singapore
Clear Glass slides Biomedia BMH 880101 Singapore, Singapore
High speed camera Photron Fastcam MC2.1 Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images
Infra Red LED Any – Generic from hardware store 940nm Infrared Light Board Singapore, Singapore
Kimwipe Kimberly Clark 34155-01LS Irving, Texas, USA
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Banerjee, A., Wu, S., Cheng, L., Aw, S. S. Fully Automated Leg Tracking in Freely Moving Insects using Feature Learning Leg Segmentation and Tracking (FLLIT). J. Vis. Exp. (158), e61012, doi:10.3791/61012 (2020).
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