Özellik Öğrenme Bacak Segmentasyon ve İzleme (FLLIT) kullanarak Serbestçe Hareket Eden Böceklerde Tam Otomatik Bacak Takibi
Summary
Biz FLLIT, serbestçe Drosophila melanogaster ve diğer böcekler hareket bacak pençe hareketi izleme için tam otomatik bir makine öğrenme yöntemi kullanmak için ayrıntılı protokoller açıklar. Bu protokoller, vahşi sinekler, mutant sinekler ve nörodejenerasyon modelleri sinek ince yürüyüş hareketleri nicel ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila modeli nörolojik fonksiyon çalışması ve nörodejenerasyon altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak için paha biçilmez olmuştur. Manipülasyon ve nöronal alt kümelerin çalışma için sinek teknikleri giderek sofistike büyüdü iken, ortaya çıkan davranışsal fenotiplerin zenginliği benzer bir ayrıntıda yakalanmış değil. Mutantlar arasında karşılaştırma için ince sinek bacak hareketleri çalışma yapabilmek için otomatik olarak ölçmek ve yüksek hız ve hızlı bacak hareketleri ölçmek için yeteneği gerektirir. Bu nedenle, serbestçe yürüyen sineklerde otomatik bacak pençesi takibi, Özellik Öğrenme tabanlı Uzuv segmentasyonu ve takibi (FLLIT) için bir makine öğrenme algoritması geliştirdik. Çoğu derin öğrenme yönteminin aksine, FLLIT tam otomatiktir ve öğrenme algoritması yerleşik morfolojik parametreleri kullanarak, kullanıcı ek açıklama için gerek kalmadan kendi eğitim setleri oluşturur. Bu makalede, FLLIT kullanarak yürüyüş analizi yürütmek için derinlemesine bir protokol açıklanmaktadır. Bu kamera kurulumu, arena yapımı, video kayıt, bacak segmentasyon ve bacak pençe izleme prosedürleri ayrıntıları. Ayrıca, her video karesinde ham izlenmiş gövde ve bacak konumlarını, 20 yürüyüş parametrelerini, 5 çizimi ve izlenen videoyu içeren FLLIT tarafından üretilen verilere genel bir bakış sunar. FLLIT kullanımını göstermek için, spinocerebellar ataksi 3 bir sinek modeli nde ilgili hastalıklı yürüyüş parametrelerini ölçmek.
Introduction
Son birkaç on yıl içinde, nörodejeneratif hastalıklar ve hareket bozuklukları bizim yaşlanan popülasyonlarda daha yaygın büyüdü. Birçok nörodejeneratif hastalık anlayışımız moleküler ve hücresel düzeyde ilerlemiş olsa da, hastalığın altında yatan etkilenen nöronal devrenin temel özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Son zamanlarda geliştirilen davranış takip araçları1,2,3,4 şimdi bize moleküler, hücresel ve devre disregülasyon altta yatan hastalığı belirlemek için hayvan hastalığı modellerinde hareket anormallikleri çalışma sağlar.
Birçok nörodejeneratif hastalıklarda yer moleküler yollar meyve sinek Drosophila melanogasterkorunur , ve Drosophila hastalığı modelleri nörodejenerasyon altında yatan temel mekanizmaları açıklamak için yardımcı oldu5,6. Yakın zamanda Parkinson Hastalığı (PD) ve Spinocerebellar ataksi 3 (SCA3) sinek modelleri farklı, ilgili insan hastalıkları1benzer korunmuş yürüyüş imzaları sergilemek gösterdi , sinek modeli belirli hareket bozukluklarında hareket bozukluğu altında yatan devre mekanizmaları anlamak için kullanılabilir gösteren. Tek gen ve tek hücre düzeyinde nöronların hedeflenen manipülasyon ve görselleştirme için sinek modeli araçların zengin ve sürekli büyüyen cephanelik7,8,9,10 sinek hastalık yolları arasındaki ilişkiyi araştırmak için ideal bir model yapar, nöronal devre ve davranışsal phenotipic tezahürü in vivo. Hassas, otomatik böcek yürüyüşü analizini sağlamak için, yakın zamanda bir makine öğrenme yöntemi, Feature Lkazanç tabanlı LImb segmentasyon ve Traflama (FLLIT)1geliştirdik.
FLLIT, daha sonra ilgili bacak pençelerini bulmak ve izlemek için kullanılan bacak piksellerini ilk bölümlere alan tam otomatik çok aşamalı bir algoritmadan oluşur. FLLIT segmentasyon için bir artırma algoritması kullanır, son çalışmada kullanılan derin öğrenme algoritmaları aksine2,3. Her iki çerçeve için de kıvrımlı sinir ağları ile bazı benzerlikler vardır, özellik çıkarma otomatik olarak kvolutional çekirdekleri öğrenme yoluyla yapılır. FLLIT’nin ilk adımı, otomatik olarak pozitif (bacaklarda piksel) ve yüksek güvene sahip negatif (arka plan veya sinek gövdesindeki pikseller) eğitim örneklerini oluşturmak için morfolojik işlemlerin (kenar ve iskeletleştirme) kullanılmasını içerir. Bu nedenle, FLLIT tam otomatiktir ve kullanıcı açıklamalı eğitim örnekleri gerektirmez. Yukarıdaki eğitim örneklerini kullanarak, bir sınıflandırıcı daha sonra bir artırma algoritması çerçevesinde eğitilir. Zayıf sınıflandırıcıların bir topluluk yinelemeli, her özellik çıkarma ve bir karar ağacı için kvolutional çekirdekleri bir dizi oluşan öğrenilir. Son öğrenilen sınıflandırıcı daha sonra bacak segmentasyonu için kullanılır ve daha iyi zor bölgeleri / sert örnekleri morfolojik işlemlerdaha iyi ayırt etmek mümkün, izleme için genel bir çok daha doğru segmentasyon üreten1. Parçalı bacaklardan, ipuçlarını bulur uzatır ve Macar algoritmasını kullanarak takip ederiz: her uçtarafından taşınan mesafenin toplamı en aza indirilmiş olacak şekilde çerçeveler arasında ipuçlarını eşleştirerek. FLLIT, son görülen konumu hatırlayarak tıkanma durumlarını (sinek merkezli koordinatlarda) işleyebilir, böylece bir bacak ucu artık tıkanma altında kaldıktan sonra geri kazanılır.
Daha önce FLLIT otomatik ve doğru bacak hareketleri izlemek ve işaretsiz, serbestçe hareket eden sinek veya örümcek yüksek hızlı video1yürüyüş analiz gösterdi ; FLLIT bu nedenle eklembacak takibi için geniş uygulanabilir olmalıdır. Morfolojik parametreleri kullanarak makine öğrenimi eğitim setleri ayıklayarak, FLLIT otomatik olarak segment ve en derin öğrenme yöntemleri için gerekli olan zahmetli manuel açıklama, gerek kalmadan böcek bacakları izlemek için kendini eğitiyor. FLLIT dolayısıyla tam otomatiktir. Bacak segmentasyonu ve takibinden sonra FLLIT, her video karesinde ham izlenmiş gövde ve bacak pozisyonları, 20 yürüyüş parametresi, 5 çizim ve yürüyüş analizi ve yürüyüş hareketlerinin görselleştirilmesi için izlenen bir video üretir. Bu protokol, FLLIT kullanmak için adım adım bir kılavuz sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazmasında, biz ayrıntılı olarak FLLIT, otomatik bir makine öğrenme programı1kullanarak ilgili adımları açıklamak , serbestçe Drosophilayürüyüş analiz etmek . İzleme ve veri analizinden sonra, FLLIT otomatik olarak vücut ve bacak pençeleri konumsal bilgi için ham veri üretir, yirmi gövde ve yürüyüş özellikleri yanı sıra yürüyüş görselleştirme sağlamak için izlenen sinek bir video üreten.
Drosophila ve diğer hayvanların bacak hareketi izleme için yöntemler bir dizi şimdi vardır1,2,3,4,14,1515,16, araştırmacılar deney hedeflerine bağlı olarak seçenekleri geniş bir yelpazede vererek. Bunlardan bazıları son derece doğru ama algılama yüzeyi 4 ile sadece pençe temas noktaları rapor ayak baskı tabanlı yaklaşımlar vardır4,14. Öte yandan, son derin öğrenme yaklaşımları2,3,16 son derece çok yönlüdür, herhangi bir hayvanbacak eklemleri ve diğer vücut parçalarının izlenmesi gerektiren davranışların analizi sağlayan, algoritmalar ilk kullanıcı açıklamalı veri setleri ile eğitilmesi gerektiğini uyarı ile. Yaklaşım üçüncü bir tür pençe pozisyonları tanımlamak için her bacak anahat bulmak için morfoloji veya görüntü kontrast tabanlı yöntemler1,15,17 kullanır. Genel olarak, bu yöntemler bacakların çapraz olduğu davranışlarla kötü bir şekilde ilgilidir (örn. tımar sırasında). FLLIT, bacak segmentasyonu için bir artırıcı algoritma eğitmek için morfolojik parametreleri kullanarak ikinci ve üçüncü yaklaşımları birleştirir. Bu, FLLIT’nin, makine öğrenimini kullanarak doğruluğu artırırken, eğitim veri kümesini oluşturmak için kullanıcı ek açıklamalarının zahmetli görevini atlamasına olanak tanır. FLLIT’de yapılacak iyileştirmeler, daha karmaşık davranışların analizine olanak sağlamak için bacakların çapraz geçtiği örneklerle uğraşmak zorunda kalacaktır.
FLLIT aydınlatma, kayıt çözünürlüğü ve kare hızı1hafif değişikliklere dayanıklıdır. Ancak, kaydedilen videoların kare hızı 250 fps’nin altına düşmemelidir ve FLLIT 1000 fps hızında kaydedilen videolar için en iyi şekilde çalışır. Görüntülerde hareket bulanıklığı varsa, ki bu bir insan ek açıklamacısının bacak pozisyonunu belirlemesi zorlaşıyorsa, FLLIT bu karelerde bacak uçlarını doğru bir şekilde tanımlayamayacaktır. Bunun ışığında, kameranın bacak uçlarına keskin bir şekilde odaklanması şarttır. Segmentasyon yapıtlarını önlemek için, arena iyice temizlenmeli ve kayıt sırasında taşınmamalıdır. Doğru arka plan çıkarma ve temiz segmentasyon için, sinek kayıt sırasında en az bir gövde uzunluğu hareket etmelidir, duraklatma olmadan. Otomatik segmentasyon ve tüm bacakların etiketleme takip sonra kontrol edilmelidir. Sinek yürüyüşü yanlış izlenmezse veya izlenmezse, dosya El Ile İzLe seçeneğini (adım 5.2.7 – 5.2.10) kullanılarak el ile yeniden izlenmelidir.
Nörodejeneratif hastalıklar ve hareket bozuklukları yaşlanan toplumlarımızda giderek daha sık görülür. Nörodejenerasyon Fly modelleri fazla 2 00yıldır çalışılmıştır, sırasında gelişmeler hastalık patofizyolojisi moleküler ve hücresel yönleri ile ilgili yapılmıştır. Ancak, hastalığın belirli davranışsal sonuçlarını değerlendirmek teknik olarak zor olmuştur. Örneğin, sinek titreme hareketleri raporları yapılmış olsa da18,19, Bu sayısal yakınzamanakadar incelenmemişti 1 . Tırmanma tsay yararlı ve nicel, henüz nispeten kaba ölçmekolmuştur 6. Bu teknik açık da benzer şekilde diğer hayvan modellerinde yüksek çözünürlüklü hareket analizini engellemiştir. Davranış analizi için yeni araçların gelişi, dolayısıyla, araştırmacılar ın nöromüsküler hastalıkların moleküler ve hücresel mekanizmaları hayvan modellerinde belirli davranışsal sonuçlara yol nasıl çalışma sağlamak için hareket bozuklukları alanında gençleştirmek için söz verdi. Bu yazıda ve önceki çalışmamızda1, biz SCA3 modelleri hiperkinetik ataksik yürüyüş sergileyen uçan FLLIT kullanarak gösterdi, PD sinek modelleri bir hipokinetik sert yürüyüş sergilerken, ilgili insan hastalıklarının hareket işaretleri özetleyen1. Yürüyüş analizi ayrıca spesifik hareket bozukluklarının altında yatan farklı nöronal popülasyonları belirlememizi sağladı. İleriye dönük olarak, ayrıntılı hareket analizi, sinek mevcut güçlü görüntüleme ve fonksiyonel araçlar ile birlikte, bize lokomotor disfonksiyon mekanizmaları içine yeni bir fikir elde etmek için izin verecektir, devre mekanizmaları ile ilgili nörodejeneratif hastalıklar anlayışımızı aydınlatan.
FLLIT yaygın olarak diğer küçük eklembacaklılar yürüyüş çalışması için geçerli olmalıdır, daha önce örümcek bacakhareketleriizlemek için son derece doğru olduğu gösterilmiştir 1 . Burada patojenik yürüyüş ve altta yatan devreleri ölçmek için ayrıntılı hareket fenotiplerinin kullanımına odaklanırken, hareket takibindeki ilerlemeler zaten devrim yaratmış ve normal yürüyüş koordinasyonu ve yürüyüş ve onun altında yatan devreler üzerinde, özellikle evrim ağacının sayısız farklı dallarında, üzerinde sürekli bir etki yaratacaktır.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik destek için Moumita Chatterjee ve Alice Liu teşekkür etmek istiyorum, ve Bloomington Drosophila Stok Merkezi (Indiana, ABD) mevcut Drosophila suşları bu çalışmada kullanılan yapmak için. Bu çalışma Singapur Moleküler ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü tarafından desteklenmiştir; Biyoinformatik Enstitüsü, Singapur; Bilim Teknoloji ve Araştırma Ortak Konseyi Örgütü Ajansı (Hibe numarası 15302FG149 SA ve LC için); Singapur Sağlık Bakanlığı Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/TCR/013-NNI/2014 sa), Alberta Üniversitesi (LC’ye başlangıç hibesi) ve Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grant (hibe numarası RGPIN-2019-04575-LC) tarafından yönetilen Klinik Araştırma Amiral Gemisi Programı (Parkinson Hastalığı).
Materials
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
Riferimenti
- Wu, S., et al. Fully automated leg tracking of Drosophila neurodegeneration models reveals distinct conserved movement signatures. PLoS Biology. 17 (6), 3000346 (2019).
- Mathis, A., et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nature Neuroscience. 19, 1281-1289 (2018).
- Pereira, T. D., et al. Fast animal pose estimation using deep neural networks. Nature Methods. 16 (1), 117-125 (2019).
- Machado, A. S., Darmohray, D. M., Fayad, J., Marques, H. G., Carey, M. R. A quantitative framework for whole-body coordination reveals specific deficits in freely walking ataxic mice. eLife. 4, (2015).
- Lu, B., Vogel, H. Drosophila models of neurodegenerative diseases. Annual Reviews in Pathology. 4, 315-342 (2009).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetica. 201 (2), 377-402 (2015).
- Dionne, H., Hibbard, K., Cavallaro, A., Kao, J. -. C., Rubin, G. M. Genetic reagents for making split-GAL4 lines in Drosophila. bioRxiv. , (2017).
- Cande, J., et al. Optogenetic dissection of descending behavioral control in Drosophila. eLife. 7, (2018).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), 2967-2976 (2015).
- Xie, T., et al. A Genetic Toolkit for Dissecting Dopamine Circuit Function in Drosophila. Cell Reports. 23 (2), 652-665 (2018).
- Warrick, J. M., et al. Ataxin-3 suppresses polyglutamine neurodegeneration in Drosophila by a ubiquitin-associated mechanism. Molecular Cell. 18 (1), 37-48 (2005).
- Ebersbach, G., et al. Comparative analysis of gait in Parkinson’s disease, cerebellar ataxia and subcortical arteriosclerotic encephalopathy. Brain. 122 (7), 1349-1355 (1999).
- Stolze, H., et al. Typical features of cerebellar ataxic gait. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 73 (3), 310-312 (2002).
- Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Marka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild type and sensory deprived Drosophila melanogaster. eLife. 2, 00231 (2013).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Clark, D. A. The manifold structure of limb coordination in walking Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Gunel, S., et al. DeepFly3D, a deep learning-based approach for 3D limb and appendage tracking in tethered, adult Drosophila. eLife. 8, (2019).
- Isakov, A., et al. Recovery of locomotion after injury in Drosophila melanogaster depends on proprioception. The Journal of Experimental Biology. 219, 1760-1771 (2016).
- Aw, S. S., Lim, I. K. H., Tang, M. X. M., Cohen, S. M. A Glio-Protective Role of mir-263a by Tuning Sensitivity to Glutamate. Cell Reports. 19 (9), 1783-1793 (2017).
- Eberl, D. F., Duyk, G. M., Perrimon, N. A genetic screen for mutations that disrupt an auditory response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14837-14842 (1997).
