Tracciamento delle gambe completamente automatizzato negli insetti in movimento liberamente utilizzando la segmentazione e il tracciamento delle gambe di apprendimento delle funzionalità (FLLIT)
Summary
Descriviamo protocolli dettagliati per l’utilizzo di FLLIT, un metodo di apprendimento automatico completamente automatizzato per il monitoraggio del movimento degli artigli delle gambe in Drosophila melanogaster e altri insetti in movimento libero. Questi protocolli possono essere utilizzati per misurare quantitativamente i sottili movimenti dell’andatura deatrale in mosche di tipo selvatico, mosche mutanti e modelli di mosca di neurodegenerazione.
Abstract
Il modello Drosophila è stato prezioso per lo studio della funzione neurologica e per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari alla base della neurodegenerazione. Mentre le tecniche di mosca per la manipolazione e lo studio di sottoinsiemi neuronali sono diventate sempre più sofisticate, la ricchezza dei fenotipi comportamentali risultanti non è stata catturata con un dettaglio simile. Per essere in grado di studiare i sottili movimenti delle gambe volanti per il confronto tra mutanti richiede la capacità di misurare e quantificare automaticamente i movimenti delle gambe ad alta velocità e rapidi. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un algoritmo di apprendimento automatico per il monitoraggio automatico degli artigli delle gambe nei mosche che camminano liberamente, la segmentazione e il monitoraggio degli arti basati su funzionalità di Apprendimento (FLLIT). A differenza della maggior parte dei metodi di deep learning, FLLIT è completamente automatizzato e genera i propri set di training senza la necessità di annotazione dell’utente, usando parametri morfologici incorporati nell’algoritmo di apprendimento. In questo articolo viene descritto un protocollo approfondito per l’esecuzione dell’analisi dell’andatura tramite FLLIT. Descrive in dettaglio le procedure per la configurazione della telecamera, la costruzione dell’arena, la registrazione video, la segmentazione delle gambe e il monitoraggio degli artigli delle gambe. Fornisce inoltre una panoramica dei dati prodotti da FLLIT, che include le posizioni del corpo e delle gambe tracciate non elaborate in ogni fotogramma video, 20 parametri di andatura, 5 grafici e un video tracciato. Per dimostrare l’uso di FLLIT, quantifichiamo i relativi parametri di andatura malatificata in un modello fly di Spinocerebellar atassia 3.
Introduction
Negli ultimi decenni, le malattie neurodegenerative e i disturbi del movimento sono diventati più diffusi nelle nostre popolazioni che invecchiano. Anche se la nostra comprensione di molte malattie neurodegenerative è avanzata a livello molecolare e cellulare, le caratteristiche fondamentali dei circuiti neuronali colpiti alla base della malattia rimangono poco compresi. Gli strumenti di tracciamento comportamentale sviluppati di recente1,2,3,4 ora ci permettono di studiare le anomalie di movimento nei modelli di malattia animale al fine di identificare la malattia di base della disregolazione molecolare, cellulare e dei circuiti.
Percorsi molecolari coinvolti in molte malattie neurodegenerative sono conservati nel mosca della frutta Drosophila melanogaster, e modelli di malattia di Drosophila hanno contribuito a chiarire i meccanismi fondamentali alla base della neurodegenerazione5,6. Recentemente abbiamo dimostrato che i modelli a mosca di Malattia di Parkinson (PD) e Spinocerebellar ataxia 3 (SCA3) presentano firme di andatura distinte e conservate che assomigliano a quelle delle rispettive malattie umane1,dimostrando che il modello di mosca può essere utilizzato per comprendere i meccanismi del circuito alla base della disfunzione del movimento in specifici disturbi del movimento. Il ricco e in continua crescita arsenale di strumenti nel modello di mosca per la manipolazione mirata e la visualizzazione dei neuroni al singolo gene e al livello a singola cellula7,8,9,10 rende la mosca un modello ideale per sondare il rapporto tra vie della malattia, circuiti neuronali e manifestazione fenotipica comportamentale in vivo. Per consentire un’analisi precisa e automatizzata dell’andatura degli insetti, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di apprendimento automatico, Feature L a reddito di LImb segmentazione e T racking (FLLIT)1.
FLLIT è costituito da un algoritmo multifase completamente automatizzato che prima segmenta i pixel delle gambe, che vengono successivamente utilizzati per individuare e tracciare i corrispondenti artigli delle gambe. FLLIT utilizza un algoritmo di potenziamento per la segmentazione, a differenza degli algoritmi di deep learning utilizzati nel recente lavoro2,3. Ci sono alcune somiglianze con le reti neurali convoluzionali in quanto per entrambi i framework, l’estrazione delle funzionalità viene eseguita automaticamente attraverso l’apprendimento dei kernel convoluzionali. Il primo passo in FLLIT consiste nell’utilizzare operazioni morfologiche (bordo e scheletrizzazione) per generare automaticamente campioni di allenamento positivi (pixel sulle gambe) e negativi (sfondo o pixel sul corpo di mosca) con alta sicurezza. Di conseguenza, FLLIT è completamente automatizzato e non richiede campioni di formazione con annotato dall’utente. Usando gli esempi di training precedenti, viene quindi eseguito il training di un classificatore nel framework di un algoritmo di incremento. Un insieme di classificatori deboli è imparato in modo iterativo, con ciascuno costituito da un insieme di kernel convoluzionali per l’estrazione di funzionalità e un albero delle decisioni. Il classificatore finale appreso viene quindi utilizzato per la segmentazione delle gambe ed è in grado di discernere meglio le regioni difficili/campioni duri rispetto alle operazioni morfologiche, producendo una segmentazione complessiva mente molto più accurata per il tracciamento1. Dalle gambe segmentate, localifichiamo le punte e le tracciamo usando l’algoritmo ungherese: abbinando le punte tra i telai in modo che la somma della distanza spostata da ogni punta sia ridotta al minimo. FLLIT è in grado di gestire i casi di occlusione ricordando l’ultima posizione vista (in coordinate centrate dal volo) in modo che una punta della gamba venga recuperata una volta che non è più in occlusione.
In precedenza abbiamo dimostrato che FLLIT può monitorare automaticamente e con precisione i movimenti delle gambe e analizzare l’andatura in una mosca o un ragno non marcato e in movimento liberamente dal video ad alta velocità1; FLLIT dovrebbe quindi essere ampiamente applicabile per il tracciamento delle gambe artrodi. Estraendo set di formazione di apprendimento automatico utilizzando parametri morfologici, FLLIT si allena automaticamente per segmentare e tracciare le gambe degli insetti senza la necessità di un’annotazione manuale laboriosa, che è necessaria per la maggior parte dei metodi di deep learning. FLLIT è quindi completamente automatizzato. Dopo la segmentazione e il tracciamento delle gambe, FLLIT produce automaticamente le posizioni del corpo e delle gambe tracciate non elaborate in ogni fotogramma video, 20 parametri di andatura, 5 grafici e un video tracciato per l’analisi dell’andatura e la visualizzazione dei movimenti dell’andatura. Questo protocollo fornisce una guida dettagliata all’utilizzo di FLLIT.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, descriviamo in dettaglio i passaggi necessari per utilizzare FLLIT, un programma automatico di apprendimento automatico1, per analizzare l’andatura nella Drosophilaliberamente a piedi . Dopo il tracciamento e l’analisi dei dati, FLLIT genera automaticamente i dati grezzi per le informazioni di posizione degli artigli del corpo e delle gambe, producendo venti caratteristiche del corpo e dell’andatura, nonché un video della mosca tracciata per consentire la visualizzazione dell’andatura.
Ci sono ora una serie di metodi per il monitoraggio del movimento delle gambe della Drosophila e di altri animali1,2,3,4,14,15,16, dando ai ricercatori una vasta gamma di opzioni a seconda degli obiettivi dell’esperimento. Alcuni di questi sono approcci basati sulla stampa di piedi, che sono altamente precisi, ma che riportano solo punti di contatto artiglio con la superficie di rilevamento4,14. D’altra parte, recenti approcci di deep learning2,3,16 sono altamente versatili, consentendo l’analisi dei comportamenti che richiedono il monitoraggio delle articolazioni delle gambe e di altre parti del corpo in qualsiasi animale, con l’avvertenza che gli algoritmi devono prima essere addestrati con set di dati annotati dall’utente. Un terzo tipo di approccio utilizza metodi di morfologia o a contrasto di immagini1,15,17 per trovare il contorno di ogni gamba per identificare le posizioni degli artigli. In generale, questi metodi si occupano male di comportamenti in cui le gambe si incrociano (ad esempio durante la toelettatura). FLLIT combina il secondo e il terzo approccio, utilizzando parametri morfologici per addestrare un algoritmo di potenziamento per la segmentazione delle gambe. Ciò consente a FLLIT di ignorare l’attività laboriosa dell’annotazione dell’utente per generare il set di dati di training, migliorando al contempo la precisione tramite l’apprendimento automatico. I miglioramenti futuri a FLLIT dovranno affrontare i casi in cui le gambe si incrociano, per consentire l’analisi di comportamenti più complessi.
FLLIT è robusto per lievi cambiamenti di illuminazione, risoluzione di registrazione e velocità del telaio1. Tuttavia, la velocità dei fotogrammi dei video registrati non deve scendere al di sotto dei 250 fps e FLLIT viene eseguita in modo ottimale per i video registrati a 1000 fps. Se nelle immagini è presente una sfocatura di movimento, in modo tale che sia difficile per un annotatore umano identificare la posizione della gamba, FLLIT non sarà in grado di identificare con precisione le punte delle gambe in quei fotogrammi. Alla luce di questo, è essenziale che la fotocamera sia messa a fuoco nitida sulle punte delle gambe. Per evitare artefatti di segmentazione, l’arena deve essere pulita accuratamente e non deve essere spostata durante la registrazione. Per una sottrazione accurata dello sfondo e una segmentazione pulita, la mosca dovrebbe spostare almeno una lunghezza del corpo durante la registrazione, senza mettere in pausa. Dopo la segmentazione e il tracciamento automatici, è necessario controllare l’etichettatura di tutte le gambe. Se l’andatura a mosca non viene tracciata o tracciata in modo errato, il file deve essere ripercorso manualmente utilizzando l’opzione Avvia manualmente il rilevamento (passaggio 5.2.7 – 5.2.10).
Le malattie neurodegenerative e i disturbi del movimento sono sempre più diffusi nelle nostre società di invecchiamento. I modelli di neurodegenerazione sono stati studiati per più di 2 decenni, durante i quali sono stati fatti progressi per quanto riguarda gli aspetti molecolari e cellulari della fisiofisiologia della malattia. Tuttavia, le specifiche conseguenze comportamentali della malattia sono state tecnicamente difficili da valutare. Ad esempio, mentre sono state fatte segnalazioni di movimenti tremanti nella mosca18,19, questi non erano stati studiati quantitativamente fino a poco tempofa 1. Il saggio di arrampicata è stato un utile e quantitativo, ma misura relativamente grossolana6. Questo deficit tecnico ha ostacolato allo stesso modo l’analisi del movimento ad alta risoluzione in altri modelli animali. L’avvento di nuovi strumenti per l’analisi comportamentale, quindi, promette di ringiovanire il campo dei disturbi del movimento per consentire ai ricercatori di studiare come i meccanismi molecolari e cellulari delle malattie neuromuscolari portano a risultati comportamentali specifici nei modelli animali. In questo articolo e nel nostro lavoro precedente1, abbiamo mostrato utilizzando FLLIT che i modelli fly di SCA3 presentano un’andatura atassica ipercinetica, mentre i modelli di mosca PD esibiscono un’andatura rigida ipocinetica, ricapitolando i segni del movimento delle rispettive malattie umane1. L’analisi dell’andatura ci ha anche permesso di identificare popolazioni neuronali distinte alla base di specifiche disfunzioni del movimento. In futuro, l’analisi dettagliata del movimento, combinata con i potenti strumenti di imaging e funzionali disponibili nella mosca, ci permetterà di ottenere nuove informazioni sui meccanismi della disfunzione locomotoria, illuminando la nostra comprensione delle malattie neurodegenerative rispetto ai meccanismi del circuito.
FLLIT dovrebbe essere ampiamente applicabile per studiare l’andatura in altri piccoli artropodi, come è stato dimostrato in precedenza di essere altamente preciso per il monitoraggio dei movimenti delle gambe di ragno1. Mentre ci concentriamo qui sull’uso della fenotipizzazione dettagliata del movimento per quantificare l’andatura patogena e i suoi circuiti sottostanti, i progressi nel tracciamento del movimento hanno già rivoluzionato, e avranno un impatto continuo sulla comprensione del normale coordinamento e dell’andatura del camminare e dei suoi circuiti sottostanti, specialmente in una miriade di diversi rami dell’albero evolutivo.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Moumita Chatterjee e Alice Liu per il supporto tecnico, e il Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana, USA) per aver reso disponibili i ceppi di Drosophila utilizzati in questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dall’Istituto di biologia molecolare e cellulare di Singapore; l’Istituto di Bioinformatica di Singapore; l’Organizzazione per la tecnologia scientifica e l’organizzazione congiunta del Consiglio (numero di sovvenzione 15302FG149 a SA e LC); il Clinical Research Flagship Programme (Malattia di Parkinson) amministrato dal Singapore Ministero della Salute National Medical Research Council (numero di sovvenzione NMRC/TCR/013-NNI/2014 a SA), l’Università dell’Alberta (startup grant to LC), e il Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant (numero di sovvenzione RGPIN-2019-04575 a LC).
Materials
| Acrylic Sheets | Dama | 1.6 mm thickness, Clear sheets | Singapore, Singapore |
| Clear Glass slides | Biomedia | BMH 880101 | Singapore, Singapore |
| High speed camera | Photron | Fastcam MC2.1 | Tokyo, Japan. A shutter speed of 1 msec or faster is ideal to reduce motion blur of captured images |
| Infra Red LED | Any – Generic from hardware store | 940nm Infrared Light Board | Singapore, Singapore |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155-01LS | Irving, Texas, USA |
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