通过宫内注射诱导利普托门宁皮细胞修饰
Summary
我们描述了一种宫内注射，在头尖弯曲的针头可以稳定在头骨上，从而消除了对底层腹腔损伤的风险。该方法可用于脑膜蛋白酶细胞的基因命运图谱和操作，以及跟踪脑脊液运动。
Abstract
此处概述的协议描述了如何通过蓄水池安全、手动注入溶液，同时消除对底层帕伦奇马的损害风险。以前发布的协议建议使用直针，应降低至从杜面表面到最大 1-2 毫米。一旦硬膜被刺穿，阻力突然下降，使得很难将针头保持在稳定的位置。相反，我们的方法使用一根针弯曲在尖端，可以稳定在头骨的骨骼上，从而防止注射器在透过杜拉膜后渗透到组织中。该过程简单明了，可重复，不会在操作的动物中引起持久的不适。我们描述了血管脑蛋白酶细胞遗传命运图的背景下的宫内注射策略。此外，同样的技术也可以用来解决广泛的研究问题，例如通过基因消融这些现象，探讨利普托明病在神经发育和细菌性脑膜炎传播中的作用。此外，该程序可与自动输注系统相结合，实现持续输送，并通过注射荧光标记分子跟踪脑脊液运动。
Introduction
脑皮细胞是一种类似成纤维细胞的细胞群，它们组织成一层薄薄的细胞，覆盖大脑，表达与胶原蛋白交联有关的基因（例如，Dcn和Lum），以及建立脑脑电明屏障（例如，Cldn11）1、2。1,2脑膜细胞涉及广泛的生理功能，从严格控制脑脊液排水3到指导发育中的大脑中神经祖细胞44、5。5最近的一项研究还提出，新生儿中的耳皮层可能含有径向胶质状细胞，这些细胞会迁移到脑皮质瘤中，并发育成功能性皮质神经元6。
细胞体位于靠近表面星体细胞附近，并与它们共享，以及其他帕伦奇马尔星体，表达connexin-30（Cx30）7。7下面概述的外科手术允许通过一次性将内毒素输送到转基因小鼠的水箱中，在Cx30+ 细胞中表达tdTomato（即使用CreER-loxP系统进行命运映射）对这些脑膜炎细胞进行+广泛和具体的标签。Endoxifen 是塔莫西芬的活性代谢物，与塔莫西芬一样诱导克里尔表达细胞的重组。然而，它是推荐用于局部应用的解决方案，因为它溶解在5-10%的DMSO中，而不是高浓度的乙醇。此外，内氧西芬不会跨越脑脑阻隔，从而能够对脑皮质细胞进行特定的重组，而无需标记基础Cx30+天体胶质种群（参见代表性结果）。
此处介绍的技术旨在通过直接进入水仙子，手动安全地将化合物注入脑脊液中。与其他需要颅骨切除术的更具侵入性的程序不同，这种方法允许在不造成颅骨或脑筋皮损伤的情况下注入化合物。因此，它与由激活皮质胶质细胞触发的炎症反应的诱导无关。与,88、9、109之前描述的其他注射策略类似，本办法依赖于覆盖水箱的肌酸-四面体膜的外科暴露，在钝刻颈部肌肉解剖后。10然而，与其他程序不同，我们建议在尖端弯曲针头，在给剂期间，针对骨骼可以稳定。这将防止针头穿透太深和损害潜在的小脑和髓线的风险。
此外科手术与谱系追踪调查兼容，旨在绘制细胞身份的变化和通过层形层的迁移路线。它也可以适应基因消融研究，旨在探讨利皮质细胞在健康和疾病中的作用，如它们对皮质发育5或细菌性脑膜炎的传播的贡献,3，11。最后，当与野生动物中荧光示踪剂的传递相结合时，可用于跟踪脑脊液运动。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处概述的协议提供了一个简单且可重复的过程，用于标记脂肪映射的利普托明尼细胞。我们使用甲氧西芬（塔莫西芬的活性代谢物）的内腔注射，诱导Cx30-CreER中tdTomato荧光报告器的表达;R26R-tdTomato小鼠1212，1313。
与其他用于通过气囊9获得脑脊液的规程相比，我们的方法确保了安全手动管理，这要归功于使用弯曲?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了瑞典研究理事会、瑞典癌症协会、瑞典战略研究基金会、克努特·奥赫·爱丽丝·瓦伦贝格斯·斯蒂夫瑟斯和卡罗林斯卡研究所干细胞和再生医学战略研究方案的资助。
Materials
| Anesthesia unit | Univentor 410 | 8323102 | Complete of vaporizer, chamber, and tubing that connects to chamber and mouse head holder |
| Anesthesia (Isoflurane) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Commercial name Rymadil |
| Cyanoacrylate glue | Carl Roth | 0258.1 | Use silk 5-0 sutures, in alternative |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton syringe (30G beveled needle) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mouse head holder | Narishige International | SGM-4 | With mouth piece for inhalational anhestetics. Alternatively, use a stereotactic frame |
| Scissors | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Shaver | Aesculap | GT420 | |
| Sterile absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile cotton swabs are also a good option |
| Surgical separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Tweezers | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch&Lomb Nordic AB | 541760 |
Riferimenti
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to the brain via intercellular junctions. Frontiers in Neuroscience. 9, 16 (2015).
- Weller, R. O., Sharp, M. M., Christodoulides, M., Carare, R. O., Mollgard, K. The meninges as barriers and facilitators for the movement of fluid, cells and pathogens related to the rodent and human CNS. Acta Neuropathologica. 135 (3), 363-385 (2018).
- Choe, Y., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. A cascade of morphogenic signaling initiated by the meninges controls corpus callosum formation. Neuron. 73 (4), 698-712 (2012).
- Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139 (3), 597-609 (2009).
- Bifari, F., et al. Neurogenic Radial Glia-like Cells in Meninges Migrate and Differentiate into Functionally Integrated Neurons in the Neonatal Cortex. Cell Stem Cell. 20 (3), 360-373 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins?. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Ramos, M., et al. Cisterna Magna Injection in Rats to Study Glymphatic Function. Methods in Molecular Biology. 1938, 97-104 (2019).
- Xavier, A. L. R., et al. Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents. Journal of Visualized Experiments. (135), (2018).
- Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid beta. Science Translational Medicine. 4 (147), (2012).
- Coureuil, M., Lecuyer, H., Bourdoulous, S., Nassif, X. A journey into the brain: insight into how bacterial pathogens cross blood-brain barriers. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 149-159 (2017).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
- Slezak, M., et al. Transgenic mice for conditional gene manipulation in astroglial cells. Glia. 55 (15), 1565-1576 (2007).
- Hardy, S. J., Christodoulides, M., Weller, R. O., Heckels, J. E. Interactions of Neisseria meningitidis with cells of the human meninges. Molecular Microbiology. 36 (4), 817-829 (2000).
- Colicchio, R., et al. The meningococcal ABC-Type L-glutamate transporter GltT is necessary for the development of experimental meningitis in mice. Infection and Immunity. 77 (9), 3578-3587 (2009).
- Ricci, S., et al. Inhibition of matrix metalloproteinases attenuates brain damage in experimental meningococcal meningitis. BMC Infectious Diseases. 14, 726 (2014).
