सी एलिगेंस जर्मलाइन में रिब्रोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स असेंबली के सीटू डिटेक्शन में निकटता लिगेशन परख का उपयोग कर
Summary
यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस जर्मलाइन में सीटू में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए निकटता लिगेशन परख के उपयोग को दर्शाता है।
Abstract
यह समझना कि प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) कब और कहां होते हैं, कोशिका में प्रोटीन फ़ंक्शन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और विकास जैसी व्यापक प्रक्रियाएं कैसे प्रभावित होती हैं। कैनोरहैब्डिटिस एलेग्नस जर्मलाइन पीपीआई का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल प्रणाली है जो स्टेम सेल, मेयोसिस और विकास के नियमन से संबंधित है। विभिन्न प्रकार की अच्छी तरह से विकसित तकनीकें हैं जो मानक एंटीबॉडी द्वारा मान्यता के लिए ब्याज के प्रोटीन को टैग करने की अनुमति देती हैं, जिससे इस प्रणाली को निकटता लिगेशन परख (पीएलए) प्रतिक्रियाओं के लिए लाभप्रद बना दिया जाता है। नतीजतन, पीएलए यह दिखाने में सक्षम है कि पीपीआई वैकल्पिक दृष्टिकोणों की तुलना में अधिक प्रभावी ढंग से जर्मलाइन में स्थानिक और लौकिक तरीके से कहां होते हैं । यहां वर्णित सी एलिगेंस जर्मलाइन में पीपीआई की जांच करने के लिए इस तकनीक के आवेदन और मात्राकरण के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Introduction
80% से अधिक प्रोटीन ों के अन्यअणुओंके साथ बातचीत होने का अनुमान है , जो इस बात पर जोर देता है कि सेल2में विशिष्ट जैविक कार्यों के निष्पादन के लिए पीपीआई कितना महत्वपूर्ण है । कुछ प्रोटीन बड़े परिसरों की असेंबली को सुविधाजनक बनाने वाले हब के रूप में कार्य करते हैं जो सेल सर्वाइवल के लिए आवश्यक हैं1. ये हब कई पीपीआई में मध्यस्थता करते हैं और प्रोटीन को एक नेटवर्क में व्यवस्थित करने में मदद करते हैं जो सेल3में विशिष्ट कार्यों की सुविधा प्रदान करता है । प्रोटीन परिसरों का गठन जैविक संदर्भ से भी प्रभावित होता है, जैसे विशिष्ट बातचीत भागीदारों की उपस्थिति या अनुपस्थिति4,सेल सिग्नलिंग घटनाओं, और एक कोशिका के विकासात्मक चरण।
सी एलिगेंस आमतौर पर विकास सहित विभिन्न अध्ययनों के लिए एक आदर्श जीव के रूप में उपयोग किया जाता है। इस जानवर की सरल शरीर रचना में कई अंग शामिल हैं, जिनमें गोनाड, आंत और पारदर्शी छल्ली शामिल है, जो कीड़ा विकास के विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। गोंद में रहने वाली जर्मलाइन यह अध्ययन करने के लिए एक महान उपकरण है कि कैसे जर्मलाइन स्टेम सेल गेमट्स5 में परिपक्व होते हैं जो भ्रूण में विकसित होते हैं और अंततः संतान की अगली पीढ़ी। जर्मलाइन के डिस्टल टिप क्षेत्र में आत्म-नवीनीकरण स्टेम कोशिकाओं का एक पूल होता है(चित्रा 1)। स्टेम सेल आला छोड़ने के रूप में, वे मेयोटिक पचिटेन में प्रगति करते हैं और अंततः युवा वयस्क चरण(चित्रा 1)में ओसाइट्स में विकसित होते हैं। जर्मलाइन में विकास के इस कार्यक्रम को विभिन्न तंत्रों के माध्यम से कसकर विनियमित किया जाता है, जिसमें आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी)6द्वारा सुविधा प्रदान किए जाने वाले पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल नियामक नेटवर्क शामिल हैं। पीपीआई इस नियामक गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण हैं, क्योंकि आरबीपीएस अपने कार्यों को लागू करने के लिए अन्य कोकारकों के साथ संबद्ध है।
ऐसे कई दृष्टिकोण हैं जिनका उपयोग कीड़ा में पीपीआई की जांच करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक की अनूठी सीमाएं हैं। वीवो इम्यूनोप्रिसिप्रिशन (आईपी) में प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों को पूरे कृमि अर्क से अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह दृष्टिकोण यह नहीं बताता है कि कीड़ा में पीपीआई कहां होता है। इसके अलावा, प्रोटीन परिसर जो विकास के एक विशिष्ट चरण के दौरान या सीमित संख्या में कोशिकाओं के रूप में क्षणिक और केवल रूप में होते हैं, सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन द्वारा ठीक करना मुश्किल हो सकता है। अंत में, आईपी प्रयोगों को lysis और आत्मीयता मैट्रिक्स पर प्रोटीन की गैर विशिष्ट अवधारण के बाद प्रोटीन जटिल पुनर्वर्गीकरण की चिंताओं को दूर करने की जरूरत है ।
पीपीआई के सीटू डिटेक्शन में वैकल्पिक दृष्टिकोण सह-इम्यूनोस्टेनिंग, फॉर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरटी), और द्विआणविक फ्लोरेसेंस पूरण (बीएफसी) हैं। सह इम्यूनोस्टेनिंग निश्चित कृमि ऊतक में ब्याज के दो प्रोटीन का एक साथ पता लगाने और सिग्नल सहस्थानीयकरण की सीमा के माप पर निर्भर करता है। सुपर-रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग, जो मानक माइक्रोस्कोपी7की तुलना में अधिक विस्तार प्रदान करता है, 200-300 एनएम8के विवर्तन-सीमित बाधा से परे प्रोटीन कोस्थानीयकरण का अधिक कड़ाई से परीक्षण करने में मदद करता है। हालांकि, पारंपरिक और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दोनों का उपयोग करके सह-इम्यूनोस्टेनिंग अच्छी तरह से परिभाषित स्थानीयकरण पैटर्न के साथ प्रोटीन के लिए सबसे अच्छा काम करता है। इसके विपरीत, यह फैलाना वितरित बातचीत भागीदारों के लिए बहुत कम जानकारीपूर्ण हो जाता है। ओवरलैप के आधार पर संकेतों के सह-स्थानीयकरण के लिए मापने से इस बारे में सटीक जानकारी नहीं मिलती कि प्रोटीन एक दूसरे के साथजटिल हैं यानहीं 9,10।
इसके अलावा, प्रोटीन-प्रोटीन परिसरों के सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन और सह-इम्यूनोस्टेनिंग मात्रात्मक नहीं हैं, जिससे यह निर्धारित करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है कि क्या ऐसी बातचीत महत्वपूर्ण है । FRET और BiFC दोनों फ्लोरोसेंट आधारित तकनीक हैं। FRET फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) के साथ ब्याज के प्रोटीन टैगिंग पर निर्भर करता है कि स्पेक्ट्रल ओवरलैप है जिस पर एक एफपी (दाता) से ऊर्जा एक और एफपी (स्वीकारकर्ता)11को हस्तांतरित किया जाता है । ऊर्जा के इस गैर-विकिरणीय हस्तांतरण के परिणामस्वरूप स्वीकारकर्ता एफपी का फ्लोरेसेंस होता है जिसे उत्सर्जन की अपनी संबंधित तरंगदैर्ध्य में पता लगाया जा सकता है। बीएफसी वीवो मेंफ्लोरोसेंट प्रोटीन के पुनर्गठन पर आधारित है . यह दो पूरक टुकड़ों में बंटवारे GFP जरूरत पर जोर देता है, जैसे हेलिक्स 1-10 और हेलिक्स १११२,जो तो ब्याज के दो प्रोटीन के लिए जुड़े रहे हैं । यदि ये दो प्रोटीन बातचीत करते हैं, तो जीएफपी के पूरक टुकड़े गुना और इकट्ठा होने के निकटता में काफी करीब हो जाते हैं, जीएफपी फ्लोरोफोर को फिर से तैयार करते हैं। पुनर्गठित जीएफपी को सीधे फ्लोरेसेंस के रूप में मनाया जाता है और इंगित करता है कि पीपीआई कहां हुई है।
जैसे, एफआरईटी और बीआईएफसी दोनों बड़े फ्लोरोसेंट टैग पर निर्भर करते हैं जो टैग किए गए प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं। इसके अलावा, FRET और BiFC सटीक डेटा प्राप्त करने के लिए टैग प्रोटीन की प्रचुर मात्रा में और तुलनीय अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । FRET उन प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है जहां एक साथी दूसरे से अधिक है, जो उच्च पृष्ठभूमि13का कारण बन सकता है। बीएफसी प्रयोगों में अतिअभिव्यक्ति से भी बचा जाना चाहिए, क्योंकि इससे गैर-विशिष्ट असेंबली14 को प्रेरित किया जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप पृष्ठभूमि में वृद्धि होती है। दोनों तकनीकों को टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति और इमेजिंग स्थितियों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, जो प्रयोगों को पूरा करने के लिए आवश्यक समय को लम्बा कर सकती है।
निकटता लिगेशन परख (पीएलए) एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है जो ऊपर उल्लिखित तकनीकों की सीमाओं को संबोधित कर सकता है। पीएलए प्राथमिक एंटीबॉडी का लाभ उठाता है जो ब्याज के प्रोटीन (या उनके टैग) को पहचानता है। ये प्राथमिक एंटीबॉडी तब माध्यमिक एंटीबॉडी से बंधे होते हैं जिनमें ओलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच होती है जो 40 एनएम (या छोटी) दूरी15के भीतर एक-दूसरे के साथ संकरण कर सकते हैं। जिसके परिणामस्वरूप संसंकरित डीएनए एक पीसीआर प्रतिक्रिया के माध्यम से परिलक्षित होता है, जो डीएनए के पूरक जांच द्वारा पाया जाता है । इसके परिणामस्वरूप फोसी होता है जो माइक्रोस्कोप द्वारा कल्पना की जाती है। यह तकनीक जटिल ऊतकों (यानी, कृमि गोंड़) में सीटू में पीपीआई का पता लगा सकती है, जो विकास और भेदभाव के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं वाली असेंबली लाइन के रूप में आयोजित की जाती है। पीएलए के साथ, पीपीआई को सीधे एक निश्चित कृमि गोंड में कल्पना की जा सकती है, जो विकास के एक विशिष्ट चरण के दौरान पीपीआई होते हैं या नहीं, इसकी जांच करने के लिए लाभप्रद है। पीएलए पीपीआई का अधिक से अधिक समाधान प्रदान करता है, जैसा कि सह-स्थानीयकरण आधारित परखों के विपरीत है, जो सटीक माप बनाने के लिए आदर्श है । यदि उपयोग किया जाता है, तो सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में सेल के भीतर पीएलए फोसी के स्थान के बारे में बेहतर विवरण प्रदान करने की क्षमता है। एक और लाभ यह है कि पीएलए प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप फोसी को इमेजजे-आधारित विश्लेषण कार्यप्रवाह द्वारा गिना जा सकता है, जिससे यह तकनीक मात्रात्मक हो जाती है।
dynein प्रकाश श्रृंखला के LC8 परिवार पहले dynein मोटर परिसर16 के एक उपइकाई के रूप में वर्णित किया गया था और एक कार्गो एडाप्टर के रूप में सेवा करने की परिकल्पना की । अपनी प्रारंभिक खोज के बाद से, एलसी8 में डिनेइन मोटर कॉम्प्लेक्स17,18,1919,20के अलावा कई प्रोटीन परिसरों में पाया गया है । एलसी 8 इंटरैक्शन मोटिफ19 में मौजूद प्रोटीन सीक्वेंस के लिए स्कैनिंग से पता चलता है कि एलसी8 में विभिन्न प्रोटीनों की एक विस्तृत सरणी17,18,19,,20 ,21,21,22के साथ कई बातचीत हो सकती है । नतीजतन, एलसी 8 परिवार प्रोटीन को अब हब माना जाता है जो बड़े प्रोटीन परिसरों19,,22की असेंबली को बढ़ावा देने में मदद करते हैं, जैसे आंतरिक रूप से अस्त-व्यस्त प्रोटीन21की विधानसभाएं ।
एक सी एलिगेंस एलसी 8-फैमिली प्रोटीन, डायनेइन लाइट चेन-1 (डीएलसी-1), कई ऊतकों में व्यापक रूप से व्यक्त किया जाता है और विशिष्ट उपकोशिकीय संरचनाओं में समृद्ध नहींहोता है 23,,24। नतीजतन, सी एलिगेंस में डीएलसी-1 के वीवो भागीदारों में जैविक रूप से प्रासंगिक की पहचान कई कारणों से चुनौतीपूर्ण है: 1) सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिफिकेशन ऊतक स्रोत को इंगित नहीं करता है जहां बातचीत होती है; 2) विशेष भागीदारों या क्षणिक बातचीत की सीमित अभिव्यक्ति सह-इम्यूनोप्रिसिप्रिशन द्वारा बातचीत का पता लगाने की क्षमता में बाधा डाल सकती है; और 3) डीएलसी-1 का फैलाना वितरण सह-इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा संभावित साथी प्रोटीन के साथ गैर-विशिष्ट ओवरलैप की ओर जाता है। इन चुनौतियों के आधार पर पीएलए डीएलसी-1 के साथ वीवो इंटरैक्शन में परीक्षण के लिए एक आदर्श दृष्टिकोण है ।
पहले यह बताया गया है कि डीएलसी-1 सीधे के साथ बातचीत करता है और आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) एफबीएफ-223 और जीएलडी-125के लिए एक सहकारक के रूप में कार्य करता है । हमारा काम डीएलसी-1 के मॉडल को हब प्रोटीन के रूप में परोसने का समर्थन करता है और पता चलता है कि डीएलसी-1 एक इंटरैक्शन नेटवर्क की सुविधा प्रदान करता है जो19,22से आगे फैला है । जीएसटी पुलडाउन परख का इस्तेमाल करते हुए ओएमए-1 नाम की एक नई डीएलसी-1-इंटरैटिंग आरबीपी की पहचान26कर दी गई है । ओएमए-1 ओसाइट विकास और मेओटिक परिपक्वता27 के लिए महत्वपूर्ण है और कई ट्रांसलेशनल दमनकों और एक्टिवेटर28के साथ मिलकर कार्य करता है। जबकि एफबीएफ-2 और जीएलडी-1 क्रमशः स्टेम सेल और मेओटिक पचिटेन क्षेत्रों में व्यक्त किए जाते हैं, ओमा-1 को ओसाइट्स27 (चित्रा 1)के माध्यम से मेयोटिक पचिटेन से जर्मलाइन में विरूपित रूप से व्यक्त किया जाता है। इससे पता चलता है कि डीएलसी-1 गोंड़ के विभिन्न क्षेत्रों में आरबीपी के साथ परिसर बनाता है। यह भी पाया गया है कि वीवो आईपी में डीएलसी-1 और ओएमए-1 के बीच सीधी बातचीत का पालन नहीं किया जाता है। पीएलए को सी एलिगेंस जर्मलाइन में इस बातचीत का आगे अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, और परिणाम बताते हैं कि पीएलए का उपयोग कीड़ा में कई अन्य पीपीआई की जांच करने के लिए किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सी एलिगेंस जर्मलाइन में पीपीआई का अध्ययन करते समय, सह-इम्यूनोस्टेनिंग की तुलना में पीएलए द्वारा पेश किया गया उच्च संकल्प उन स्थानों के दृश्य और मात्राकरण की अनुमति देता है जहां बातचीत जर्मलाइन मे?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले कुछ सूत्रकृमि उपभेदों को एनआईएच (P40OD010440) द्वारा वित्त पोषित कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया था। कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी एनआईएच पुरस्कार P20GM103546 और S10OD021806 के समर्थन से संचालित मोंटाना बायोस्पेक्ट्रोस्कोपी कोर रिसर्च लेबोरेटरी विश्वविद्यालय में किया गया था। इस काम को NIH अनुदान GM109053 द्वारा भाग में ईवी, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन फैलोशिप 18PRE34070028 को X.W. और मोंटाना एकेडमी ऑफ साइंसेज पुरस्कार द्वारा एक्सडब्ल्यू को समर्थन दिया गया था । फंडर्स स्टडी डिजाइन या रिपोर्ट लिखने में शामिल नहीं थे । हम चर्चा के लिए एम एलेनबेकर को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| 16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
| 1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
| 1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
| 1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
| 26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
| BSA | Lampire | 7500802 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
| Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
| Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
| Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
| Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
| DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
| Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
| Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
| Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
| MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
| PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
| Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
| Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
| Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
| Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
| Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
| Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
| Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
| Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
| Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
| Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
| Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
| Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
| Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
| Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
| Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
| Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
| Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
| task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
| Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
| Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
| Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
| Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
| -20 °C freezer | |||
| -80 °C freezer | |||
| Aluminum Foil | |||
| OP50 strain E. coli | |||
| Orbital Shaker | |||
| Tape | |||
| Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
| mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
| mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |
Riferimenti
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Nooren, I. M., Thornton, J. M. Diversity of protein-protein interactions. EMBO Journal. 22 (14), 3486-3492 (2003).
- Patil, A., Kinosselecta, K., Nakamura, H. Hub promiscuity in protein-protein interaction networks. International Journal of Molecular Science. 11 (4), 1930-1943 (2010).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), e1000807 (2010).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 1-16 (2013).
- Nousch, M., Eckmann, C. R. Translational control in the Caenorhabditis elegans germ line. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 205-247 (2013).
- Vangindertael, J., et al. An introduction to optical super-resolution microscopy for the adventurous biologist. Methods and Applications in Fluorescence. 6 (2), 022003 (2018).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Thymiakou, E., Episkopou, V. Detection of signaling effector-complexes downstream of bmp4 using PLA, a proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Wang, S., et al. Detection of in situ protein-protein complexes at the Drosophila larval neuromuscular junction using proximity ligation assay. Journal of Visualized Experiments. (95), 52139 (2015).
- Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool – understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
- Kodama, Y., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC): a 5-year update and future perspectives. Biotechniques. 53 (5), 285-298 (2012).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends in Biochemical Science. 32 (9), 407-414 (2007).
- Hiatt, S. M., Shyu, Y. J., Duren, H. M., Hu, C. D. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Methods. 45 (3), 185-191 (2008).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains. Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).
- Erdős, G., et al. Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway. PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885 (2017).
- Navarro-Lérida, I., et al. Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8. Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).
- Rapali, P., et al. DYNLL/LC8: a light chain subunit of the dynein motor complex and beyond. FEBS Journal. 278 (17), 2980-2996 (2011).
- Rapali, P., et al. Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome. PLoS One. 6 (4), e18818 (2011).
- Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds. FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).
- Jespersen, N., et al. Systematic identification of recognition motifs for the hub protein LC8. Life Science Alliance. 2 (4), (2019).
- Wang, X., et al. Dynein light chain DLC-1 promotes localization and function of the PUF protein FBF-2 in germline progenitor cells. Development. 143 (24), 4643-4653 (2016).
- Dorsett, M., Schedl, T. A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).
- Ellenbecker, M., et al. Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans. Genetica. 211 (2), 665-681 (2019).
- Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation. FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).
- Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans. Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).
- Spike, C. A., et al. Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans. Genetica. 198 (4), 1513-1533 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
- Duerr, J. S. Antibody staining in C. elegans using “freeze-cracking”. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Crittenden, S., Kimble, J. Preparation and immunolabeling of Caenorhabditis elegans. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2009).
