פרוטוקול זה מדגים את השימוש בסדר הקירבה הצמוד כדי לבדוק את האינטראקציות של חלבון חלבון באתרו בתוך C. אלגיה germline.
הבנת המועד והיכן מתרחשים אינטראקציות חלבונים בחלבון (PPIs) קריטיות להבנת פונקציית החלבון בתא וכיצד תהליכים רחבים יותר כגון פיתוח מושפעים. האלקאנס הוא מערכת מודל מעולה ללימוד ppis הקשורים בוויסות תאי גזע, מיוזיס ופיתוח. יש מגוון רחב של טכניקות מפותחות המאפשרות חלבונים של עניין להיות מתויג על ידי נוגדנים סטנדרטיים, מה שהופך את זה יתרון מערכת עבור הסמיכות הצורך הקשור (PLA) תגובות. כתוצאה מכך, PLA הוא מסוגל להראות איפה PPIs להתרחש בצורה מרחבית וטמפורלית באופן יעיל יותר מאשר גישות חלופיות. המתואר כאן הוא פרוטוקול עבור יישום וכימות של טכנולוגיה זו כדי לחקור את PPIs ב -C. אלגיה germline.
מעל 80% של חלבונים מוערכים יש אינטראקציות עם מולקולות אחרות1, אשר מדגיש כיצד ppis חשוב לביצוע של פונקציות ביולוגיות ספציפיות בתא2. חלבונים מסוימים לתפקד כרכזות ההקלה על הרכבה של מתחמים גדולים יותר הנחוצים עבור הישרדות התא1. רכזות אלה מתווך PPIs מרובים ולעזור לארגן חלבונים לתוך רשת המאפשרת פונקציות ספציפיות בתא3. היווצרות של מכלולי חלבון מושפע גם על ידי הקשר הביולוגי, כגון נוכחות או היעדרות של שותפים ספציפיים אינטראקציה4, תא איתות אירועים, ובשלב ההתפתחותי של תא.
ג. אלגיה משמשת בדרך כלל כאורגניזם מודל למגוון מחקרים, כולל פיתוח. האנטומיה הפשוטה של בעל החיים מורכבת ממספר איברים, כולל הגונאד, הבטן והקוטיקולה השקופה, המאפשרת ניתוח של פיתוח תולעים. את germline המתגוררים לוטה הוא כלי נהדר ללמוד כיצד בתאי גזע germline בוגרים לתוך גמטות5 המתפתחים לעוברים ובסופו של דבר הדור הבא של צאצאי. אזור הקצה המרוחק של הגרמקו (germline) מכיל מאגר של תאי גזע המחדשים את עצמם (איור 1). כמו תאי גזע לעזוב את הנישה, הם התקדמות לתוך pachytene המיון ובסופו של דבר להתפתח oocytes בשלב המבוגר הצעיר (איור 1). תוכנית זו של פיתוח ב-germline מוסדר באופן הדוק באמצעות מנגנונים שונים, כולל רשת לאחר ההמרה הרגולציה הקלה על ידי ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs)6. PPIs חשוב עבור פעילות תקינה זו, כמו RBPs שותף עם קופנים אחרים כדי להפעיל את הפונקציות שלהם.
ישנן מספר גישות שניתן להשתמש בהן כדי לחקור עבור PPIs בתולעת, אבל לכל אחד יש מגבלות ייחודיות. ב vivo IMMUNOPRECIPITATION (IP) ניתן להשתמש כדי לבודד חלבון חלבון מתחמי מתמציות תולעת שלמות; עם זאת, גישה זו אינה מציינת היכן ה-PPI מתרחשת בתולעת. בנוסף, מתחמי חלבון כי הם ארעי ורק טופס במהלך שלב מסוים של פיתוח או במספר מוגבל של תאים יכול להיות קשה להתאושש על ידי co-immunoprecipitation. לבסוף, ניסויים בקניין רוחני צריכים לטפל בחששות של מורכבות חלבון לאחר הליזה ושימור לא ספציפי של חלבונים על מטריצת הזיקה.
גישות חלופיות לאיתור באתרו של ppis כתמים שיתוף חיסוני, Förster תהודה העברת אנרגיה (לדאוג), ומשלימה ביולקולרית הקומפלמנטציה (bimolecular). שיתוף חיסוני מסתמך על זיהוי סימולטני של שני חלבונים של עניין רקמת תולעת קבועה ומדידה של היקף לוקליזציה של אות. שימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, המציעה פירוט רב יותר מאשר המיקרוסקופיה הסטנדרטית7, מסייע באופן מדוקדק יותר לבדוק לוקליזציה חלבון מעבר למכשול עקיפה-מוגבל של 200-300 ננומטר8. עם זאת, התאמה חיסונית משותפת באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונאלי ברזולוציה סופר עובד הטוב ביותר עבור חלבונים עם דפוסי לוקליזציה מוגדרים היטב. לעומת זאת, הוא הופך להיות הרבה פחות אינפורמטיבי לשותפים בעלי אינטראקציה מבוזרת. מדידה להתאמה משותפת של אותות המבוססים על חפיפה אינה מספקת מידע מדויק על האם החלבונים מורכבים זה מזה9,10.
יתר על כן, co-immunoprecipitation ושיתוף חיסוני של מכלולי חלבון-חלבון אינם כמותיים, מה שהופך אותו מאתגר כדי לקבוע אם אינטראקציות כאלה הן משמעותיות. מדובר בשתי טכניקות המבוססות על פלורסנט. מסתמך על תיוג חלבונים של עניין עם חלבונים פלורסנט (FPs) כי יש חפיפה ספקטרלית שבה אנרגיה מאחד FP (תורם) מועבר אחר FP (קבלה)11. זו העברה לא רדיוטיבית של תוצאות האנרגיה הפלואורסצנטית של הקבלה FP שניתן לזהות בתוך הגל המתאים של פליטה. BiFC מבוססת על החוקה של חלבון פלורסנט ב vivo. זה כרוך בפיצול GFP לשני שברים משלימים, כגון ה1-10 ו סליל 1112, אשר התמזגו אז שני חלבונים של ריבית. אם שני החלבונים האלה אינטראקציה, השברים המשלימים של GFP להיות קרובים מספיק בסמיכות לקפל ולהרכיב, המהווים מחדש את fluorophore GFP. מחדש GFP הוא הבחין במישרין כמו פלואורסצנטית ומציין היכן PPI התרחשה.
ככזה, הן גם לדאוג וגם BiFC תלוי תגי פלורסנט גדול שיכול לשבש את הפונקציה של חלבון מתויג. בנוסף, יש לבקש ממנו ביטוי שופע ודומה של החלבונים המתויגים להשגת נתונים מדויקים. לא ניתן להתאים לניסויים שבהם שותף אחד הוא עודף של השני, אשר יכול להוביל לרקע גבוה13. ביטוי יתר בניסויים BiFC יש גם להימנע, כי זה יכול לגרום להרכבה לא ספציפית14 כי התוצאה היא מוגברת הרקע. שתי הטכניקות דורשות אופטימיזציה של הביטוי ותנאי הדימות של חלבונים מתויגים, אשר עשוי להאריך את הזמן הנדרש כדי להשלים ניסויים.
הטיפול הצמוד (PLA) הוא גישה חלופית שיכולה לטפל במגבלות הטכניקות המוזכרות לעיל. PLA מנצל את הנוגדנים העיקריים המכירים את חלבוני הריבית (או התגים שלהם). נוגדנים ראשוניים אלה מאוגדים לאחר מכן על ידי נוגדנים משניים המכילים בדיקה מחדש של olig, שיכולים לhybridize אחד עם השני כאשר בתוך 40 ננומטר (או קצר) מרחק15. ה-DNA הוכלא כתוצאה מוגבר באמצעות תגובת PCR, אשר מזוהה על ידי בדיקות המשלימים את ה-DNA. זה התוצאות וקדי כי הם דמיינו על ידי מיקרוסקופ. טכנולוגיה זו יכולה לזהות PPIs באתרו רקמות מורכבות (כלומר, gonad התולעת), אשר מאורגן כקו הרכבה המכיל תאים בשלבים שונים של פיתוח ובידול. עם PLA, PPIs יכול להיות במישרין דמיינו בתוך gonad תולעת קבועה, אשר יתרון עבור חקירת האם PPIs להתרחש במהלך שלב ספציפי של פיתוח. PLA מציע ברזולוציה גבוהה יותר של PPIs לעומת שיתוף לוקליזציה מבוסס assays אשר הוא אידיאלי לעשיית מדידות מדויקות. אם נעשה שימוש, מיקרוסקופ סופר-רזולוציה יש את הפוטנציאל לספק פרטים דקים יותר על המיקום של PLA וקדי בתוך תא. יתרון נוסף הוא כי וקדי הנובע מתגובות PLA ניתן לספור על ידי זרימת עבודה מבוססי imagej ניתוח, מה שהופך את הטכניקה הזאת כמותית.
המשפחה LC8 של שרשראות האור דינאין תוארה לראשונה כיחידת משנה של דינאין מנוע קומפלקס16 ו היפותזה לשמש מתאם המטען. מאז התגלית הראשונית שלה, LC8 נמצא מתחמי חלבון מרובים בנוסף למתחם דינאין מנוע17,18,19,20. סריקת רצפי חלבונים המכילים את מוטיב LC8 אינטראקציה19 מציע כי LC8 יכול להיות הרבה אינטראקציות עם מגוון רחב של חלבונים שונים17,18,19,20,21,22. כתוצאה מכך, חלבונים LC8 משפחתיים נחשבים כעת רכזות המסייעות לקדם את ההרכבה של מכלולי חלבון גדולים יותר19,22, כגון מכלולים של חלבונים בעלי סדר מבחינה מיסודה21.
אחד C. אלגיה LC8-חלבון משפחה, דינאין אור שרשרת-1 (DLC-1), מבוטא באופן נרחב על פני רקמות רבות ולא מועשר מבנים ספציפיים subcellular23,24. כתוצאה מכך, זיהוי של רלוונטיות ביולוגית בvivo שותפים של DLC-1 ב -C. אלגיה מאתגרת מספר סיבות: 1) co-immunoprecipitation אינו מצביע על מקור הרקמה שבו האינטראקציה מתרחשת; 2) ביטוי מוגבל של שותפים מסוימים או אינטראקציות ארעי עלול לעכב את היכולת לזהות אינטראקציה על ידי co-immunoprecipitation; ו-3) לפזר התפלגות של DLC-1 מוביל חפיפה לא ספציפית עם חלבונים שותפים פוטנציאליים על ידי שיתוף חיסוני. בהתבסס על האתגרים הללו, PLA היא גישה אידיאלית לבחינות באינטראקציות vivo עם DLC-1.
בעבר דווח כי DLC-1 מקיים אינטראקציה ישירה עם ומשמש כקופקטור עבור ה-RNA-כריכת חלבונים (RBPs) FBF-223 ו gld-125. העבודה שלנו תומכת במודל של dlc-1 לשמש כחלבון hub ומציע dlc-1 מקלה על רשת אינטראקציה המתפרס מעבר דינאין19,22. באמצעות השיטה הנפתחת GT, מחדש DLC-1-אינטראקציה RBP בשם OMA-1 זוהה26. OMA-1 חשוב עבור צמיחה oocyte ו meiotic התבגרות27 פונקציות בשילוב עם מספר מrepressors translational ומפעילי28. בעוד FBF-2 ו-GLD-1 מבוטאים בתאי הגזע ואזורי pachytene, בהתאמה, OMA-1 היא ביטוי בדרך מאוד מתבטאת ב-germline מתוך pachytene meiotic באמצעות האוציטים27 (איור 1). הדבר מרמז על כך DLC-1 צורות מתחמים עם RBPs באזורים שונים של gonad. יש גם נמצא כי האינטראקציה הישירה בין DLC-1 ו-OMA אחד נצפתה בתוך מבחנה לא התאושש על ידי vivo IP. ה-PLA שימש בהצלחה כגישה חלופית למחקר נוסף זה אינטראקציה ב -C. אלגיה germline, ואת התוצאות מרמזות כי PLA ניתן להשתמש כדי לחקור ppis רבים אחרים בתולעת.
כאשר לימוד PPIs ב -C. אלגיה germline, הרזולוציה הגבוהה ביותר המוצעים על ידי PLA לעומת שיתוף חיסוני מאפשר הדמיה וכימות של מיקומים שבהם אינטראקציות להתרחש ב-germline. זה דווח בעבר כי DLC-1 לקיים אינטראקציה ישירה עם OMA-1 באמצעות שיטת מחוץ גופית בשנת 26; עם זאת, האינטראקציה הזאת לא התאושש ?…
The authors have nothing to disclose.
כמה זנים נמטודות בשימוש במחקר זה סופקו על ידי המרכז הגנטיקה של caenorהאבודיטיס ממומן על ידי NIH (P40OD010440). מיקרוסקופ confocal וקד נערך באוניברסיטת מונטנה BioSpectroscopy ליבה מעבדה מחקר פעלו עם תמיכה מ-NIH פרסים P20GM103546 ו S10OD021806. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק NIH GM109053 כדי E.V., האגודה האמריקנית לאיגוד הלבבות 18 PRE34070028 ל X.W., ופרס האקדמיה למדעים של מונטנה ל-X.W. התורמים לא היו מעורבים בתכנון הלמידה או בכתיבת הדו ח. . אנו מודים למ אלאלבקר לדיון
16% paraformaldehyde solution | Electron Microscopy services | 15710 | used to make 4% working solution |
1M KH2PO4 | Sigma | P0662 | Prepare a 1M working stock |
1x M9 | various | various | prepared as 10x stock used at 1x; see wormbook.org for protocol |
1x PBS | various | various | see wormbook.org for protocol |
26.5 Gauge Needle | Exel International | 26402 | Needles used for dissection |
BSA | Lampire | 7500802 | |
Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 05-529C | 50ml Oak ridge centrifuge tube used for synchronization |
Confocal Microscope | Zeiss | 880 | |
Coplin Jar | PolyLab | 62101 | |
Coverslip to Freeze Sample | Globe Scientific | 1411-10 | 22x40mm, No. 1 |
Coverslip to Seal Slide | Globe Scientific | 1404-15 | 22x22mm, No. 1.5 |
DAPI Mounting Medium for Immunofluorescence | Vector | H-1200 | |
Ligase | Sigma-Aldrich | DUO82029 | Duolink 1x Ligase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Amplification red buffer | Sigma-Aldrich | DUO82011 | Duolink 5x Amplification Red buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Ligation Buffer | Sigma-Aldrich | DUO82009 | Duolink 5x Ligation buffer, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Antibody Diluent | Sigma-Aldrich | DUO82008 | Duolink antibody diluent,Comes with DUO92004 and DUO92002, Note: A 1x PBS/1% BSA solution can also be used as a substitute to dilute the antibody. |
Blocking Solution | Sigma-Aldrich | DUO82007 | Duolink blocking solution, Comes with DUO92004 and DUO92002 |
Mounting Medium for PLA | Sigma-Aldrich | DUO82040 | Duolink In Situ mounting medium with DAPI |
MINUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Duolink In Situ Probe Anti-Mouse MINUS |
PLUS Probe | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Duolink In Situ Probe Anti-Rabbit PLUS |
Wash Buffer A | Sigma-Aldrich | DUO82046 | Duolink In Situ wash Buffer A |
Wash Buffer B | Sigma-Aldrich | DUO82048 | Duolink In Situ wash Buffer B |
Polymerase | Sigma-Aldrich | DUO82030 | Duolink Polymerase, Comes as part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008 |
Epifluorescent Microscope | Leica | DFC300G camera, DM5500B microscope | |
Goat anti-mouse Alexa 594 | JacksonImmuno | 115-585-146 | Use at 1:500 |
Goat anti-rabbit Alexa 488 | JacksonImmuno | 111-545-144 | Use at 1:200 |
Image Processing Software | Adobe | Adobe Photoshop + Illsutrator CS3 | |
Glass Pipette | Corning | 7095B-5X | |
Levamisole | ACROS Organics | 187870100 | Prepare a 250mM working stock |
Methanol | Fisher Scientific | A454 | |
Mouse anti-FLAG | Sigma | F1804 | Use at 1:1000 for immunofluorescence and PLA, pre-block with normal goat serum recommended |
Nailpolish | L.A. colors | CNP195 | |
Nematode Growth Medium (NGM) | various | See wormbook.org for protocol | |
Normal Goat Serum | JacksonImmuno | 005-000-121 | |
Polyethylene Pasteur Pipette | Globe Scientific | 135030 | |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | Prepared as 0.1% stock solution in water, stored at -20C, and diluted 1:100 in water to coat slides |
Petri Dishes | Tritech | PD7060 | 60 mm diameter |
Rabbit anti-GFP | Thermo Fisher | G10362 | Use at 1:200 for immunofluorescence, 1:4000 for PLA |
Slides | Thermo Fisher | 30-2066A-Brown | Three-square 14x14mm autoclavable slides with bars are custom-ordered through Fisher Scientific. Poly-L-Lysine added to slides in the lab |
Sodium Hypochlorite solution | Fisher Scientific | SS290-1 | |
task wipes | Kimtech | 34120 | 4.4×8.4 inch task wipes |
Trays (242x241x20mm) | Thermo Fisher | 240845 | Used to make humid chamber |
Triton X-100 | ACROS Organics | 327372500 | |
Ultrapure water | Milli-Q | Ultrapure water obtained from Milli-Q Integral Water Purification System | |
Watchglass | Carolina Biological | 742300 | |
-20 °C freezer | |||
-80 °C freezer | |||
Aluminum Foil | |||
OP50 strain E. coli | |||
Orbital Shaker | |||
Tape | |||
Nematode strains used in this study (both available upon request) | |||
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475] | UMT 376 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Reference 24 | |
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III | UMT 422 | dlc-1 prom::3xFLAG::dlc-1::dlc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Reference: this study |