ويقدر أن أكثر من 80٪ من البروتينات لديها تفاعلات مع الجزيئات الأخرى¹، مما يؤكد على مدى أهمية PPIs لتنفيذ وظائف بيولوجية محددة في الخلية². تعمل بعض البروتينات كمحاور تسهل تجميع المجمعات الأكبر الضرورية لبقاء الخلية¹. هذه المحاور التوسط PPIs متعددة وتساعد على تنظيم البروتينات في شبكة تسهل وظائف محددة في الخلية³. كما يتأثر تكوين مجمعات البروتين بالسياق البيولوجي، مثل وجود أو عدم وجود شركاء محددين يتفاعلون^4،وأحداث إشارات الخلايا، ومرحلة نمو الخلية.

C. يستخدم الإيغانك ككائن حي نموذجي لمجموعة متنوعة من الدراسات، بما في ذلك التنمية. يتكون التشريح البسيط لهذا الحيوان من عدة أعضاء ، بما في ذلك الغدد التناسلية والأمعاء وبشرة شفافة ، مما يسهل تحليل تطور الدودة. الخط الجرثومي المقيم في الغدد التناسلية هو أداة عظيمة لدراسة كيفية نضج الخلايا الجذعية الجرثومية إلى gametes⁵ التي تتطور إلى أجنة وفي نهاية المطاف الجيل القادم من ذرية. تحتوي منطقة الطرف المنفّر من الخط الجرثومي على مجموعة من الخلايا الجذعية المجددة ذاتيًا(الشكل 1). كما الخلايا الجذعية ترك مكانة، فإنها تتقدم إلى pachytene meiotic وتتطور في نهاية المطاف إلى البويضات في مرحلة الكبار الشباب(الشكل 1). يتم تنظيم هذا البرنامج من التنمية في خط الجراثيم بإحكام من خلال آليات مختلفة، بما في ذلك شبكة تنظيمية ما بعد النسخ التي تسهلها البروتينات الملزمة الحمض النووي الريبي (RBPs)⁶. وتتسم مؤشرات أسعار الشراكة بين القطاعين العام والخاص بأهمية هذا النشاط التنظيمي، حيث ترتبط الممارسات التجارية التقييدية بعوامل مساعدة أخرى لممارسة وظائفها.

هناك العديد من النهج التي يمكن استخدامها للتحقيق في PPIs في الدودة ، ولكن كل منها له قيود فريدة من نوعها. في الامطار المناعية على الجسم الحي (IP) يمكن استخدامها لعزل المجمعات البروتين البروتينمن مقتطفات دودة كاملة; ومع ذلك، لا يشير هذا الأسلوب إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين في الفيروس المتنقل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يصعب استرداد مجمعات البروتين العابرة وتتشكل فقط خلال مرحلة محددة من التطور أو في عدد محدود من الخلايا عن طريق الترسيب المناعي المشترك. وأخيرا، تحتاج تجارب الملكية الفكرية إلى معالجة مخاوف إعادة الفرز المعقدة البروتينية بعد الانزل والاحتفاظ غير محددة من البروتينات على مصفوفة تقارب.

النهج البديلة للكشف في الموقع من PPIs هي المناعة المشتركة، نقل الطاقة صدى Förster (FRET)، ومكملات الفلورسيان ثنائي الجزيئية (BiFC). يعتمد المناعي المشترك على الكشف المتزامن عن بروتينين مهتمين بأنسجة الديدان الثابتة وقياس مدى التوطين المشترك للإشارة. استخدام المجهر فائقة الدقة، والتي توفر تفاصيل أكبر من المجهر القياسي^7،ويساعد على اختبار أكثر صرامة توطين البروتين المشترك وراء حاجز حيود محدودة من 200-300 نانومتر⁸. ومع ذلك ، فإن المناعة المشتركة باستخدام كل من المجهر التقليدي وفائق الدقة يعمل بشكل أفضل للبروتينات ذات أنماط التعريب المحددة جيدًا. وعلى النقيض من ذلك، يصبح أقل إفادة بكثير بالنسبة للشركاء المتفاعلين الموزعين توزيعاً. قياس لتوطين مشترك للإشارات على أساس التداخل لا يوفر معلومات دقيقة حول ما إذا كانت البروتينات في معقدة مع بعضها البعض^9,10.

وعلاوة على ذلك، فإن الترسيب المناعي المشترك والمناعة المشتركة لمجمعات البروتين البروتينليست كمية، مما يجعل من الصعب تحديد ما إذا كانت هذه التفاعلات كبيرة. FRET و BiFC كلاهما تقنيات تستند إلى الفلورسنت. تعتمد FRET على وضع علامات على البروتينات ذات الأهمية مع البروتينات الفلورية (FPs) التي تتداخل الطيفية التي يتم فيها نقل الطاقة من FP واحد (المانح) إلى FP آخر (مقبول)¹¹. وينتج عن هذا النقل غير الإشعاعي للطاقة الفلورسية للFP المقبول التي يمكن اكتشافها عند الطول الموجي للانبعاثات. ويستند BiFC على إعادة تشكيل بروتين الفلورسنت في الجسم الحي. فإنه ينطوي على تقسيم GFP إلى اثنين من شظايا تكميلية، مثل الحلزون1-10 والحلزون 11^12،والتي تنصهر بعد ذلك إلى اثنين من البروتينات ذات الفائدة. إذا تفاعل هذان البروتينان، تصبح الأجزاء التكميلية من GFP قريبة بما يكفي من القرب لطيها وتجميعها، مما يعيد تشكيل فلوروفور GFP. ثم يلاحظ GFP المعاد تشكيله مباشرة على أنه فلورسين ويشير إلى مكان حدوث مؤشر أسعار المنتجين.

على هذا النحو ، يعتمد كل من FRET و BiFC على العلامات الفلورية الكبيرة التي يمكن أن تعطل وظيفة البروتين الموسوم. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب FRET و BiFC تعبيرًا وفيرًا وقابلًا للبروتينات الموسومة للحصول على بيانات دقيقة. قد لا تكون FRET مناسبة للتجارب حيث يكون أحد الشريكين أكثر من الآخر ، مما قد يؤدي إلى خلفية عالية^13. يجب أيضًا تجنب التعبير المفرط في تجارب BiFC ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى تجميع غير محدد¹⁴ يؤدي إلى زيادة الخلفية. تتطلب كلتا التقنيتين تحسين ظروف التعبير والتصوير للبروتينات الموسومة ، والتي قد تطيل الوقت اللازم لإكمال التجارب.

إن فحص ربط القرب (PLA) هو نهج بديل يمكن أن يعالج قيود التقنيات المذكورة أعلاه. يستفيد جيش التحرير الشعبي من الأجسام المضادة الأولية التي تتعرف على البروتينات ذات الأهمية (أو علاماتها). ثم يتم ربط هذه الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على تحقيقات oligonucleotide التي يمكن أن تهجين مع بعضها البعض عندما ضمن مسافة 40 نانومتر (أو أقصر)¹⁵. يتم تضخيم الحمض النووي الهجين الناتج عن ذلك من خلال تفاعل PCR ، والذي يتم اكتشافه بواسطة المسابير التي تكمل الحمض النووي. وهذا يؤدي إلى بؤر التي يتم تصورها بواسطة المجهر. يمكن لهذه التكنولوجيا الكشف عن PPIs في الموقع في الأنسجة المعقدة (أي الغدد التناسلية دودة)، والتي يتم تنظيمها كخط تجميع يحتوي على خلايا في مراحل مختلفة من التطور والتمايز. مع جيش التحرير الشعبي، يمكن تصور PPIs مباشرة في الغدد التناسلية دودة ثابتة، وهو أمر مفيد للتحقيق في ما إذا كان PPIs تحدث خلال مرحلة محددة من التنمية. يقدم جيش التحرير الشعبي دقة أكبر لمؤشرات أسعار التطبيقات مقارنة بالمقالات القائمة على التعريب المشترك ، وهو مثالي لإجراء قياسات دقيقة. إذا ما استخدمت، المجهري ة فائقة الدقة لديه القدرة على توفير تفاصيل أدق حول موقع بؤر جيش التحرير الشعبى الصينى داخل الخلية. ميزة أخرى هي أن بؤر الناتجة عن ردود فعل جيش التحرير الشعبي يمكن أن تحسب من قبل سير عمل تحليل ImageJ المستندة إلى، مما يجعل هذه التقنية الكمية.

تم وصف عائلة LC8 من سلاسل الضوء الدينين لأول مرة بأنها وحدة فرعية لمجمع محركات dynein¹⁶ وافترض أنها بمثابة محول بضائع. منذ اكتشافه الأولي، تم العثور على LC8 في مجمعات البروتين متعددة بالإضافة إلى مجمع محركات الدينين^{17،18،19،20.} المسح الضوئي لتسلسل البروتين التي تحتوي على التفاعل LC8 عزر¹⁹ يشير إلى أن LC8 قد يكون لها العديد من التفاعلات مع مجموعة واسعة من البروتينات المختلفة^17،18،^{,19،20،21،22}. ونتيجة لذلك، تعتبر الآن البروتينات العائلية LC8 المحاور التي تساعد على تعزيز تجميع مجمعات البروتين اتّفا ً^19،22، مثل تجميع البروتينات المفككة بشكل جوهري²¹.

واحد C. elegans LC8-الأسرة البروتين، dynein سلسلة الضوء-1 (DLC-1)، وأعرب على نطاق واسع عبر العديد من الأنسجة وليس المخصب في هياكل محددة تحت الخلوية^23،,24. وبالتالي، فإن تحديد الصلة بيولوجيا ً في الحياة العضوية في الشركاء في DLC-1 في C. elegans يشكل تحدياً لعدد من الأسباب: 1) عدم هطول المناعة المشتركة يشير إلى مصدر الأنسجة حيث يحدث التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه التفاعل؛ (2) لا يشير الهطول المناعي المشترك إلى مصدر الأنسجة الذي يحدث فيه 2) التعبير المحدود عن شركاء معينين أو تفاعلات عابرة قد تعيق القدرة على الكشف عن التفاعل عن طريق الترسيب المناعي المشترك؛ و 3) توزيع منتشر من DLC-1 يؤدي إلى تداخل غير محدد مع البروتينات الشريك المحتملة عن طريق المناعة المشتركة. وبناء على هذه التحديات، جيش التحرير الشعبي هو نهج مثالي لاختبار في تفاعلات الجسم الحي مع DLC-1.

وقد أفيد سابقا أن DLC-1 يتفاعل مباشرة مع ويعمل كعامل مساعد للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة²³ (RBPs) FBF-23 وGLD-1²⁵. يدعم عملنا نموذج DLC-1 الذي يعمل كبروتين محوري ويشير إلى أن DLC-1 يسهل شبكة التفاعل التي تمتد إلى ما بعد dynein^19،22. باستخدام تقسيم السحب GST, تم التعرف على RBP DLC-1 التفاعل الجديد اسمه OMA-1²⁶. OMA-1 مهم لنمو البويضات والنضج الميوطي²⁷ ويعمل بالتزامن مع عدد من المكبوتات والمنشطات المترجمة^28. في حين يتم التعبير عن FBF-2 و GLD-1 في الخلايا الجذعية ومناطق pachytene meiotic ، على التوالي ، يتم التعبير عن OMA-1 بشكل منتشر في الخط الجرثومي من pachytene meiotic من خلال البويضات²⁷ (الشكل 1). وهذا يشير إلى أن DLC-1 تشكل مجمعات مع RBPs في مناطق مختلفة من الغدد التناسلية. كما تبين أن التفاعل المباشر بين DLC-1 و OMA-1 الذي لوحظ في المختبر لا يتم استرداده بواسطة IP في الجسم الحي. وقد استخدم جيش التحرير الشعبى الصينى بنجاح كنهج بديل لمزيد من دراسة هذا التفاعل في خط الجراثيم C. elegans، وتشير النتائج إلى أنه يمكن استخدام جيش التحرير الشعبي للتحقيق في العديد من PPIs الأخرى في الدودة.