移植質評価のための化学バイオプシーの使用

すべての動物は、カナダのオンタリオ州国立衛生研究所が発表した全米医学研究所と「実験動物のケアガイド」によって策定された「実験動物ケアの原則」に従って人道的ケアを受けました。トロント総合研究所の動物ケア委員会は、すべての研究を承認しました.研究は、人間の被験者は、Torunのビドゴシュチニコラウスコペルニクス大学のコレギウムメディクムの生物倫理委員会によって承認されました. 注: 適切な倫理委員会から承認を得る。常に安全手袋を着用することを忘れないでください。SPMEプローブの抽出段階には触れないでください。非アクティブ化ガラスバイアルの使用は、リピドミック分析に推奨されます。 1. プローブの準備 7 mm の混合モードの吸着剤でコーティングされたチタンニッケル合金プローブ(長さ 40 mm、直径 0.2 mm)を準備します。プローブの数は、手順全体の間に対象となる時間ポイントとレプリケートの回数によって異なります (3 は、時間ポイントあたりに推奨されます)。注: 抽出フェーズの長さとタイプは、研究のモード、代謝物の極性、およびサンプルマトリックスに基づいて調整できます。 2:1 クロロホルム:メタノール (v/v) で構成される洗浄混合物を準備します。各2.0 mLガラスバイアルに溶液の1.0mLをピペットし、各バイアルにキャップを通して突き刺さった1つのプローブを配置する。注:使用前に、汚染粒子を除去するためにすべてのプローブを清掃してください。 バイアルを攪拌機に置き、攪拌速度を1,200 rpmに設定します。45分後、装置を停止し、LC-MS等級水でコーティングをすすきます。 コーティングは、それらを活性化するために事前調整ステップを受ける必要がありますので、1:1メタノール:水(v /v)で構成される事前調整混合物を準備します。各2.0 mLガラスバイアルに溶液の1.0mLをピペットし、各バイアルにキャップを通して突き刺さった1つのプローブを配置する。 バイアルをボルテックス攪拌機に置き、攪拌速度を1,200 rpmに設定します。 60分後、攪拌機を停止し、LC-MSグレードの水でコーティングをすすきます。 標準的な外科装置の殺菌の議定書に従って調査を殺菌する。 2. 抽出 滅菌環境を確保するために、サンプリングの直前に滅菌パッケージを開きます。 各時点で10分間、腎臓皮質に直接2つのプローブを挿入します。コーティングの全長は、組織マトリックスで覆われなければなりません。特定の角度は必要ありませんが、ca. 90 degは通常使用されます。注:医療処置全体は、所定の機関の標準プロトコルに従います。SPME サンプリングに関する変更は考慮されません。この手順には、次の 6 つのサンプリング タイム ポイントが含まれます。a) 腎臓切除の前に, ドナーから生体内;b)-e)1時間後、3時間、5時間、7時間の腎臓灌流、臓器室でのex vivo;f)再灌流後、レシピエントから生体内で。 プローブを組織から引き出して引き込み、LC-MSグレードの水でコーティングをリンスし、コーティング表面から残りの血液を取り除きます。手術部位から離れ、プローブを除去した直後に洗い流す。 3. 輸送と保管 プローブを別々のバイアルに入れ、閉じます。 バイアルをドライアイスで満たされた発泡スチロールボックスに入れるか、液体窒素に入れ、輸送します。 サンプルを冷凍庫(-80°C)に保存するか、すぐに脱着工程を開始します。 4. 脱着 メタボロミック分析用の80:20アセトニトリル:水(v/v)、リピドミック分析用のイソプロパノール:メタノール(v/v)で構成される脱離液を準備します。 2.0 mLに入れてバイアルにラベル付けされた1つのプローブを挿入し、以前にキャップを貫通したプローブを各バイアルに入れる溶液のパイプ100 μL。 バイアルをボルテックス攪拌機に置き、120分間1,200 rpmで攪拌速度を設定します。 バイアルからプローブを取り外します。得られた抽出物は、インストゥルメンタル分析の準備が整いました。 5. LC-MS分析 LC-MSシステムのオートサンプラーに抽出物を含むバイアルを配置します。注: この研究では、液体クロマトグラフィー(RP、HILIC)と高解像度質量分析と軌道質量分析計を組み合わせたものが使用されました。メタボロミック解析パラメータの場合は、ステップ 5.2 に進みます。リピソミック分析パラメータについては、ステップ5.6に進みます。 逆相分離にはペンタフルオロフェニル(PFP)カラム(2.1mm x 100 mm、3 μm)を使用します。 流量を300μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと25°Cに設定します。 次の割合に従って移動相を準備します: 移動相 A: 水:ギ酸:ギ酸 (99.9:0.1, v/v), および移動相 B: アセトニトリル: ギ酸 (99.9:0.1, v/v).移動相流を次のパラメータに従って設定します:移動相流を開始する(0-3分):100%Aに続いて線形勾配を10%A(3-25分)、34分まで10%Aのアイソクラティックフローで終わり、続いてカラムの再平衡時間の6分を続ける。 HILIC 分離の場合は、HILIC カラム(2.0 mm x 100 mm、3 μm、200A)を使用してください。流量を400 μL/minに設定します。 次の割合に従って移動相を準備する:移動相A:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(9:1、v/v、有効塩濃度20mM)、移動相B:アセトニトリル:酢酸アンモニウム緩衝液(1:1、v/v、有効塩濃度20mM)。 移動相流量を100%Aで開始し、3.0分保持してから5分以内に100%Bにランプを設定します。100%Bで12分まで保持し、続いてカラムの再平衡時間を8分保持します。 スキャン範囲を 85~1000 m/z に設定します。正イオン化モードでHESIイオン源パラメータを設定:スプレー電圧1,500 V、キャピラリー温度300°C、シースガス40 a.u.、auxガス流量15 au、プローブヒーター温度300°C、S-Lens RFレベル55%。 分析された各サンプル(定期的に、10-12サンプルごと)の10 μLからなるQCサンプルを実行して、計測器の性能を監視します。 逆相分離の場合は、C18カラム(2.1 mm x 75 mm、3.5 μm)を使用してください。 流量を200μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと55°Cに設定します。次の割合に従って移動相を準備する: 移動相 A: H2O:MeOH (60:40, v/v), 10 mM酢酸アンモニウムおよび1 mM酢酸;移動相B:IPA:MeOH(90:10、v/v)、10 mM酢酸アンモニウムおよび1 mM酢酸。 次のパラメータに従って移動相流を設定する:0-1分(20%B)、1-1.5分(20-50%B)、1.5-7.5分(50-70%B)、7.5-7- 13分(70-95%B)、13-17分(95%B)、17-17.1分(95-20%B)、17.1-23分(20%)。 HILIC 分離の場合は、HILIC カラム(100 x 2.1 mm、3 μm)を使用します。 流量を400μL/minに、オートサンプラーとカラム温度をそれぞれ4°Cと40°Cに設定します。 次の割合に従って移動相を準備します: 移動相 A: ACN;移動相B:水中の酢酸アンモニウム5m。次のパラメータに従って移動相流を設定します:0-2分(96%B)、2-15分(96-80%B)、15-15.1分(80-96%B)、15.1-21分(96%B)。 HESIイオン源パラメータをプラスイオン化モードで設定して、電圧3,500V、キャピラリー温度275°C、シースガス20 a.u、auxガス流量10、プローブヒーター温度300°C、S-Lens RFレベル55%に設定します。 分析された各サンプル(10~12サンプルごと)の10μLからなるQCサンプルを実行して、計測器の性能を監視します。 計測器と互換性のあるソフトウェアでデータ収集を行います。 6. データ分析 非標的メタボロミクスおよびリピドミクス分析専用ソフトウェアを使用して、データ処理、推定識別、統計分析を実行します。注: 主成分分析 (PCA) と箱ひげ図を取得して、データ構造を視覚化することができます。