Utilizzo di una biopsia chimica per la valutazione della qualità dell'innesto

La valutazione della qualità degli organi rimane una grande sfida per i medici, che devono prendere decisioni rapide e informate in merito alla possibilità di un determinato organo per il trapianto o se debba essere scartato. Fattori multipli, come l’età del donatore, la durata dell’ischemia e le infezioni e i processi infiammatori, possono influenzare l’esito dell’innesto a lungo termine. Mentre sono stati sviluppati metodi diversi fino ad oggi per diagnosticare la funzione dell’allotrapianto renale, l’ispezione istopatologica rimane lo standard d’oro in quella^{materia 3,4,12}. Anche se la procedura di biopsia può produrre informazioni significative per quanto riguarda la malattia del donatore preesistente e i cambiamenti vascolari, non è esigante di difetti. Gli errori di campionamento associati alla variabilità del server interob e al campionamento di glomeruli insufficienti per informazioni complete sulla funzione degli organi rimangono preoccupazioni tipiche a questo proposito. Inoltre, la preparazione del campione comporta alcune questioni come una valutazione incompleta dell’innesto in caso di sezioni congelate e l’estensione del tempo di procedura per il sezionamento della paraffina. Tuttavia, l’aumento del rischio di emorragia, che può apparire acutamente come ematuria microscopica o grossolana, è la principale complicazione pericolosa per la vita associata alla procedura di biopsia. Per questo motivo, il numero di biopsie abili è strettamente limitato nelle procedure di trapianto, un fattore che ostacola la cattura dei cambiamenti dinamici e delle analisi delle serie a tempo attraverso questo^{metodo 12,13,14}. I benefici di un’analisi irologica devono essere confrontati con i rischi associati alla metodologia. Il valore delle scoperte istologiche è indiscutibile, ma non spiegano i meccanismi molecolari delle aberrazioni.

La metabolomica e la lippidomica sono i domini più giovani della famiglia scientifica “-omica”. Il set completo di metaboliti e lipidi umani a bassa capacità molecolare (<1,200 Da) collegati all'interno di una rete metabolica è definito come un metaboloma umano. Il genoma rimane relativamente costante per tutta la sua vita, con lievi modifiche causate da mutazioni che si verificano raramente. Il metaboloma è il prodotto dell'espressione genica, che è altamente sensibile ai cambiamenti in tutti i processi biologici e ai fattori ambientali. La natura dinamica di metaboliti e lipidi li rende indicatori perfetti^{dell’attuale}condizione dell’organo 7^,8,15,16. Il metodo SPME proposto nel suddo metodo consente di rilevare i cambiamenti che si verificano nell’organo durante la sua conservazione, a partire dalla rimozione degli organi dal corpo del donatore fino alla revascolarizzazione presso il destinatario. Il piccolo diametro della sonda (200 m) fornisce una minima invasività e consente diversi campionamenti dallo stesso organo senza causare alcun danno al tessuto. Condurre studi utilizzando il rene, come organo trapiantato più frequentemente, consente una migliore comprensione e un’ulteriore caratterizzazione delle vie metaboliche responsabili del declino della qualità e della funzione degli innesti. La possibilità di monitorare le modifiche nel tempo è certamente un importante vantaggio della tecnica rispetto ai metodi invasivi convenzionali come la biopsia. L’analisi attualmente presentata ha identificato concentrazioni alterate di vari gruppi di lipidi e metaboliti, in particolare di aminoacidi essenziali, purine, nucleosides purina e glicerophospholipids. Questi risultati sono coerenti con i precedenti rapporti di analisi^{dei tessuti 5,6,17,18,19,20}. Ad oggi, la maggior parte delle relazioni scientifiche che utilizzano metabolomica o lippidomica per spiegare i processi che inducono complicazioni dopo il trapianto o i fenomeni di lesione ischemia/reperfusione (IRI) si sono limitati all’analisi dei biofluidi^21,22,23.

Ogni applicazione clinica richiede l’ottimizzazione del protocollo di campionamento per garantire che le prestazioni del metodo analitico soddisfino i criteri previsti. A questo proposito, il vantaggio dell’utilizzo di SPME è la possibilità di adeguare le condizioni per vari progetti sperimentali. La varietà delle fasi di estrazione accessibili fornisce un ampio spettro di metaboliti estratti con polarità diversificate. Allo stesso tempo, questo potrebbe essere considerato come una limitazione del metodo a causa del fatto che ogni sorbent fornisce selettività verso caratteristiche specifiche e non estrae tutti i composti presenti nella matrice campione. Va notato che i rivestimenti SPME estraggono solo tramite molecole libere e semplicemente non interagiscono con una frazione legata dell’alyte. La biocompatibilità dei rivestimenti non introduce tossicità nel tessuto, limitando al contempo l’estrazione di molecole di grandi dimensioni come le proteine; di conseguenza, i processi enzimatici sono inibiti già nella fase di raccolta dei campioni e la presenza di manufatti è ridotta al minimo, il che è un grande vantaggio rispetto ai metodi di campionamento alternativi. La lunghezza del rivestimento influenza l’efficienza dell’estrazione (cioè, la lunghezza del rivestimento indica la superficie e il volume della fase di estrazione); così, rivestimenti più lunghi producono recuperi più elevati. D’altra parte, i rivestimenti più corti consentono una risoluzione spaziale più elevata. Per risultati affidabili, è fondamentale immergere la sonda alla stessa profondità della corteccia renale. L’inserimento troppo profondo causa il rischio di entrare nella medulla renale. Il tempo di estrazione è anche proporzionale all’efficienza di estrazione. Pertanto, la selezione del tempo di estrazione ottimale è uno dei passaggi più critici nello sviluppo del metodo SPME. L’accuratezza della misurazione del tempo fornisce la massima ripetibilità. Nelle applicazioni biologiche come quella discussa, c’è sempre un compromesso tra la sensibilità e la ripetibilità del protocollo analitico e le restrizioni della procedura medica. Mentre l’estrazione dell’equilibrio fornisce la massima sensibilità, per motivi di sicurezza, le condizioni di pre-equilibrio sono spesso utilizzate in tali applicazioni, poiché il tempo di estrazione non dovrebbe influenzare la durata totale dell’intervento chirurgico. L’efficienza della desorption è determinata dal momento del processo e dalla composizione del solvente di disorption, che dovrebbe essere compatibile con la fase mobile utilizzata per la separazione cromatografica^9,10,11.

Uno dei principali requisiti per la strumentazione diagnostica utilizzata per le valutazioni intra-chirurgiche è il tempo di analisi. Si sta cercando di sviluppare uno strumento rapido per l’estrazione SPME in vivo accoppiato direttamente a uno spettrometro di massa tramite microfluidico open interface (MOI)²⁴ o spray a lama rivestita (CBS)²⁵. Tali approcci consentirebbero la divulgazione di risultati analitici in tempo reale o quasi in tempo reale. L’uso di tali metodi per l’analisi pre-intervento dei profili metabolici e lipidomici potrebbe migliorare il processo decisionale durante le procedure di trapianto, consentendo il miglior approccio personalizzato possibile e una risposta rapida in caso di insufficienza d’organo.

Come sintesi, si ipotizza che il protocollo proposto consentirà il raggiungimento di profili metabolici e lippidomici completi degli innesti renali, che a loro volta fornirebbe una valutazione completa della qualità dell’organo e della caratterizzazione dei processi responsabili della lesione ischemia-reperfusione. La novità del progetto include l’utilizzo della microetrazione in fase solida (SPME), che offre un campionamento invasivo basso dei sistemi viventi, in combinazione con una delle tecnologie più innovative disponibili per l’analisi dei metabolomi e dei lipicomi (ad esempio, lo spettrometro di massa ad alta risoluzione Orbitrap). SPME combina la raccolta dei campioni, l’estrazione e l’appiccamento di metaboliti in un unico passaggio, rendendolo quindi uno strumento perfetto per un’analisi rapida. Si prevede che questo protocollo aiuterà a rispondere alle domande relative a quali condizioni pre-trapianto del rene sono responsabili della funzione dell’organo ritardato o delle sue disfunzioni dopo il trapianto, nonché a come il protocollo di conservazione dell’innesto influenza la biochimica dell’organo. Tali conoscenze non solo avrebbero un impatto significativo sulla prevenzione di possibili complicazioni legate al trapianto, ma potrebbero contribuire a migliorare gli attuali protocolli di conservazione dell’innesto, riducendo al minimo la perdita di tessuto da trapianto vitale e la perdita di vite umane. La soluzione proposta aprirà la porta a ulteriori indagini in questo campo, tra cui la convalida di specifici potenziali biomarcatori e il miglioramento degli esiti terapeutici nella trapiantologia.