استخدام خزعة كيميائية لتقييم جودة الكسب غير المشروع
Summary
ويعرض البروتوكول استخدام نهج الخزعة الكيميائية متبوعاً بتحليل مستقلب شامل ودهونومي لتقييم جودة ترقيع الكلى المخصصة للزرع.
Abstract
تعد زراعة الكلى علاجاً منقذاً للحياة لعدد كبير من الأشخاص الذين يعانون من خلل كلوي في المرحلة النهائية في جميع أنحاء العالم. ويرتبط هذا الإجراء مع زيادة معدل البقاء على قيد الحياة ونوعية أكبر من حياة المريض بالمقارنة مع غسيل الكلى التقليدي. للأسف، يعاني زرع من نقص في أساليب موثوقة لتقييم جودة الأعضاء. وتقتصر تقنيات التشخيص القياسية على فحص المظهر العياني أو خزعة الأنسجة الغازية، والتي لا توفر معلومات شاملة عن الكسب غير المشروع. يهدف البروتوكول المقترح إلى إدخال الطور الصلب microextraction (SPME) كوسيلة تحليلية مثالية للتحليل الشامل للاستقلابات و الدهون لجميع المركبات الجزيئية المنخفضة الموجودة في الكلى المخصصة للزراعة. صغر حجم المسبار SPME يتيح أداء خزعة كيميائية، مما يتيح استخراج الأيض مباشرة من الجهاز دون أي جمع الأنسجة. الحد الأدنى من الغازية من الطريقة يسمح تنفيذ تحليلات متعددة مع مرور الوقت: مباشرة بعد حصاد الأعضاء، أثناء الحفاظ عليها، ومباشرة بعد إعادة تنظيم الجسم في المتلقي. ومن المفترض أن الجمع بين هذه الطريقة الجديدة لأخذ العينات مع مطياف كتلة عالية الاستبانة سوف يسمح للتمييز من مجموعة من المركبات المميزة التي يمكن أن تكون بمثابة علامات بيولوجية على نوعية الكسب غير المشروع ومؤشرات التنمية المحتملة لخلل الجهاز.
Introduction
وفقًا لشبكة مشتريات الأعضاء وزرعها في الولايات المتحدة، كان هناك 94,756 مريضًا ينتظرون عمليات زرع الكلى في الولايات المتحدة في عام 2019. بينما في أوروبا في عام 2018، كان هذا العدد 10,791. كل عشر دقائق، يتم إضافة شخص ما إلى قائمة انتظار زرع الأعضاء الوطنية في الولايات المتحدة، ويقدر أن 20 شخصا يموتون كل يوم في انتظار زرع1،2. زرع الكلى هو علاج منقذ للحياة لعدد كبير من الأشخاص الذين يعانون من خلل كلوي في نهاية المرحلة في جميع أنحاء العالم. ويرتبط هذا الإجراء مع زيادة معدل البقاء على قيد الحياة ونوعية الحياة أعلى بالمقارنة مع غسيل الكلى التقليدي.
ومع ذلك، تواجه عملية زرع الأعضاء العديد من المشاكل الخطيرة، مثل نقص الأعضاء أو عدم وجود أدوات فعالة لتقييم جودة الأعضاء. وتقتصر البروتوكولات القياسية على فحص المظهر العياني أو خزعة الأنسجة الغازية ، والتي لا توفر معلومات شاملة بشأن جودة الكسب غير المشروع. في حين أن التقييم البصري يسمح لتحديد الأورام المرئية للعين ، وتشوهات التشريحية ، أو الأضرار الجسيمة التي لحقت بالطعوم ، فإن هذا النهج ذاتي للغاية ، ويختلف في فعاليته وفقًا لتجربة المراقبين. الخزعة، من ناحية أخرى، يمكن أن توفر معلومات قيمة بشأن الاضطرابات الكلوية الموجودة من قبل، وبالتالي يعتبر وسيلة من القيم الموضوعية والمبينة في تحديد نتائج الكسب غير المشروع. ومع ذلك, إجراء خزعة ليست خالية من العيوب; هناك خطر حدوث مضاعفات محتملة مثل النزيف و 4-5 ساعات إضافية من إعداد العينة مطلوبة ، مما يطيل بشكل كبير من وقت نقص التروية البارد. ولذلك ، وخاصة في أوروبا ، واستخدام تحليل الأنسجة المباشرة يقتصر على توسيع نطاق المعايير المانحين (ECD) والمتبرعين بعد الوفاة في الدورة الدموية (DCD)3،4.
وقد تم مؤخرا الاعتراف بالمت المستقلبومومات والكائنات الدهنية كنهوج واعدة لتحقيق فهم أفضل للتغيرات في المسارات الكيميائية الحيوية التي تحدث أثناء الحفاظ على الأعضاء. يمكّن التنميط الأيضي والدهني من رصد الاستجابات الفورية للنظام إلى التغيرات البيئية المفاجئة المتعلقة بإزالة الأعضاء مع عواقب لاحقة: نقص التروية، الإجهاد التأكسي، أو الاستجابات الالتهابية5،,6،,7،,8. الكلى هو الجهاز الذي يرتبط إلى حد كبير مع عمليات التمثيل الغذائي، وبالتالي قياسات الأيض وتركيزات الدهون قد تسمح بتحديد المؤشرات البيولوجية جودة الجهاز المحتملة وتمكين التنبؤات أفضل من نتائج الكسب غير المشروع.
وبالنظر إلى التعقيدات والقيود المذكورة أعلاه المرتبطة بأساليب تقييم جودة الأعضاء الحالية، هناك حاجة إلى حل تشخيصي أقل توغلاً لتقييم جودة الأعضاء السريع والمعقد. وتتوافق الطور الصلبة الدقيقة (SPME) مع هذه المتطلبات كأسلوب تحليلي طفيف التوغل الذي يتيح تغطية مجموعة واسعة من الأيض والدهون. وتستند هذه التقنية على إدخال رقيقة (~ 200 ميكرومتر), مواكب بيولوجيا, التيتانيوم والنيكل سبائك التحقيق مغطاة مع مرحلة استخراج انتقائي في الجهاز فحص لفترة قصيرة. وينبغي التأكيد على أن SPME يمنع استخراج البروتين، وبالتالي تمكين تثبيط الأيض بالفعل في مرحلة جمع العينات، والتي هي ميزة كبيرة على الطرق البديلة. وعلاوة على ذلك، فإن تصغير الجهاز يسمح لتنفيذ التحليلات المتكررة والمتزامنة من هياكل قليلة من الجهاز9،10،11.
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال تقييم جودة الأعضاء يمثل تحديًا كبيرًا للأطباء ، الذين يجب عليهم اتخاذ قرارات مستنيرة سريعة بشأن ما إذا كان جهاز معين قابلًا للزرع أو ما إذا كان يجب التخلص منه. يمكن أن تؤثر عوامل متعددة، مثل عمر المتبرع، ومدة نقص التروية، والالتهابات والعمليات الالتهابية، على نتيجة الكسب غير المشروع على المدى الطويل. في حين تم تطوير أساليب متنوعة حتى الآن لتشخيص وظيفة allograft الكلى، التفتيش الهدولوجي لا يزال المعيار الذهبي في هذه المسألة3،4،12. على الرغم من أن إجراء الخزعة يمكن أن تسفر عن معلومات هامة بشأن الأمراض المانحة الموجودة من قبل والتغيرات في الأوعية الدموية, أنها ليست خالية من العيوب. ولا تزال أخطاء أخذ العينات المرتبطة بتباين الخوادم البينية وأخذ عينات من الكبيبات غير الكافية للحصول على معلومات شاملة بشأن وظيفة الأعضاء تشكل شواغل نموذجية في هذا الصدد. وعلاوة على ذلك، إعداد عينة يجلب بعض القضايا مثل تقييم غير مكتمل من الكسب غير المشروع في حالة المقاطع المجمدة، وتمديد الوقت لإجراء قسم البارافين. ومع ذلك، فإن زيادة خطر النزيف، والتي قد تظهر بشكل حاد مثل المنظار المجهري أو الجسيم في البيلة الدموية، هي المضاعفات الرئيسية التي تهدد الحياة المرتبطة بإجراء الخزعة. لهذا السبب، عدد الخزعات المسموح بها محدودة للغاية في إجراءات زرع، وهو عامل يعوق التقاط التغيرات الديناميكية وتحليلات السلاسل الزمنية عبر هذه الطريقة12،13،14. ويجب أن تُزن فوائد التحليل النسيجي مع المخاطر المرتبطة بالمنهجية. قيمة النتائج النسيجية لا جدال فيها ، لكنها لا تفسر الآليات الجزيئية للانحرافات.
تعد “نواتج الأيض” و”دهونوم” أصغر المجالات في الأسرة العلمية “omics”. يتم تعريف المجموعة الكاملة من الأيضات والدهون البشرية المنخفضة (<1,200 Da) المتصلة داخل شبكة التمثيل الغذائي بأنها مستقلب بشري. يظل الجينوم ثابتاً نسبياً طوال حياته، مع تعديلات طفيفة ناجمة عن الطفرات التي تحدث بشكل غير متكرر. المستقلب هو نتاج التعبير الجيني، الذي حساس للغاية للتغيرات في جميع العمليات البيولوجية، فضلا عن العوامل البيئية. الطبيعة الديناميكية من المستقلبات والدهون يجعلها مؤشرات مثالية من حالة الجهاز الحالي7,8,15,16. طريقة SPME المقترحة في البروتوكول المذكور أعلاه تمكن من الكشف عن التغيرات التي تحدث في الجهاز أثناء الحفاظ عليه، بدءا من إزالة الأعضاء من جسم المتبرع حتى إعادة الهيكلة في المتلقي. يوفر القطر الصغير للمسبار (~ 200 ميكرومتر) الحد الأدنى من الغازية ويسمح بأخذ عدة عينات من نفس الجهاز دون التسبب في أي ضرر للأنسجة. إجراء الدراسات باستخدام الكلى، باعتبارها العضو الأكثر زرعا في كثير من الأحيان، ويسمح لفهم أفضل وتوصيف إضافي للمسارات الأيضية المسؤولة عن انخفاض نوعية ووظيفة الطعوم. ومن المؤكد أن إمكانية مراقبة التعديلات بمرور الوقت هي ميزة هامة لهذه التقنية بالمقارنة مع الطرق التقليدية الغازية مثل الخزعة. وحدد التحليل المقدم حالياً تركيزات معدلة لمجموعات مختلفة من الدهون والايض، وخاصة من الأحماض الأمينية الأساسية، البيورينات، النوكليوسيدات البيورينية، والجلسرينفوسفوليدس. هذه النتائج متسقة مع تقارير تحليل الأنسجة السابقة5,6,17,18,19,20. حتى الآن، فإن غالبية التقارير العلمية التي تستخدم نواتج الأيض أو الدهون لتفسير العمليات التي تحفز المضاعفات بعد زرع أو إقفار/إعادة حقنة (IRI) الظواهر تقتصر على تحليل21بيوفلوريدات،22،23.
كل تطبيق سريري يتطلب تحسين بروتوكول أخذ العينات لضمان أن أداء الطريقة التحليلية يلبي المعايير المتوقعة. وفي هذا الصدد، تتمثل الفائدة من استخدام هذا النظام في إمكانية تعديل الظروف لمختلف التصاميم التجريبية. مجموعة متنوعة من مراحل الاستخراج يمكن الوصول إليها يوفر مجموعة واسعة من المستقلبات المستخرجة مع الاستقطابات المتنوعة. وفي الوقت نفسه، يمكن اعتبار هذا تقييداً للطريقة نظراً لأن كل مواد ماصة توفر انتقائية تجاه سمات محددة ولا تستخرج جميع المركبات الموجودة في مصفوفة العينات. وتجدر الإشارة إلى أن الطلاء SPME استخراج فقط عن طريق الجزيئات الحرة، وببساطة لا تتفاعل مع جزء من التحليلات ملزمة. التوافق الحيوي للطلاء لا يدخل سمية للأنسجة مع تقييد استخراج جزيئات كبيرة مثل البروتينات; ونتيجة لذلك، فإن العمليات الأنزيمية تكبح بالفعل في مرحلة جمع العينات ويقل إلى أدنى حد وجود القطع الأثرية، مما يمثل ميزة كبيرة على طرق أخذ العينات البديلة. يؤثر طول الطلاء على كفاءة الاستخراج (أي أن طول الطلاء يحدد مساحة السطح وحجم مرحلة الاستخراج) ؛ وبالتالي، الطلاء أطول تسفر عن استرداد أعلى. من ناحية أخرى، تمكن الطلاءات الأقصر من تحقيق دقة مكانية أعلى. للحصول على نتائج موثوقة ، من المهم غمر المسبار إلى نفس العمق الدقيق لقشرة الكلى. يسبب الإدراج العميق جدًا خطر دخول النخاع الكلوي. الوقت من الاستخراج هو أيضا يتناسب مع كفاءة الاستخراج. ولذلك، اختيار وقت الاستخراج الأمثل هي واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في تطوير الأسلوب SPME. توفر دقة قياس الوقت أعلى تكرار. في التطبيقات البيولوجية مثل تلك التي تمت مناقشتها ، هناك دائما حل وسط بين حساسية وتكرار البروتوكول التحليلي والقيود المفروضة على الإجراء الطبي. في حين أن استخراج التوازن يوفر أعلى حساسية، لأسباب تتعلق بالسلامة، غالبا ما تستخدم ظروف ما قبل التوازن في مثل هذه التطبيقات، كما ينبغي أن لا يؤثر وقت الاستخراج على المدة الإجمالية للجراحة. يتم تحديد كفاءة desorption من قبل الوقت من العملية وتكوين المذيبات desorption، والتي ينبغي أن تكون متوافقة مع المرحلة المتنقلة المستخدمة للفصل الكروماتوغرافي9،10،11.
أحد المتطلبات الرئيسية للأجهزة التشخيصية المستخدمة في التقييمات الجراحية الداخلية هو وقت التحليل. وتبذل محاولات الحالية لتطوير أداة سريعة لفي استخراج في الجسم الحي SPME مقرونة مباشرة إلى مطياف الشامل عبر واجهة مفتوحة microfluidic (وزارة الداخلية)24 أو رذاذ شفرة المغلفة (سي بي اس)25. ومن شأن هذه النهوج أن تتيح الكشف عن النتائج التحليلية في الوقت الحقيقي أو القريب من الوقت الحقيقي. استخدام هذه الأساليب لتحليل ما قبل التدخل من الملامح الأيضية والدهونية يمكن أن تعزز عملية صنع القرار أثناء عمليات زرع، مما يتيح أفضل نهج شخصي ممكن والاستجابة السريعة في حالة فشل الجهاز.
على سبيل الاقتطاف، يفترض أن البروتوكول المقترح سيمكن من الحصول على كامل الملامح الأيضية والدهونية من الطعوم الكلى، والتي بدورها من شأنها أن توفر تقييما شاملا لجودة الجهاز وتوصيف العمليات المسؤولة عن إصابة الإقفار الإقفاري. وتشمل حداثة المشروع استخدام الجر المجهري المتين (SPME)، الذي يقدم عينات منخفضة التوغل من النظم الحية، بالاقتران مع واحدة من أكثر التكنولوجيات ابتكارا المتاحة لتحليل المستقلب وعلم الدهون (على سبيل المثال، مطياف الكتلة ذات الدقة العالية في Orbitrap). يجمع SPME بين جمع العينات واستخراجها وإرواءها في خطوة واحدة، مما يجعلها أداة مثالية للتحليل السريع. ومن المتوقع أن يساعد هذا البروتوكول على الإجابة على الأسئلة المتعلقة بما هي ظروف ما قبل زرع الكلى المسؤولة عن تأخر وظيفة الأعضاء أو الخلل الوظيفي بعد زرعها، وكذلك عن كيفية تأثير بروتوكول الحفاظ على الكسب غير المشروع على الكيمياء الحيوية للجهاز. وهذه المعرفة لن يكون لها تأثير كبير على الوقاية من المضاعفات المحتملة المتعلقة بزرع الأعضاء فحسب، بل قد تساعد أيضاً في تحسين بروتوكولات حفظ الكسب غير المشروع الحالية، مما يقلل من فقدان أنسجة زرع الأعضاء القابلة للحياة وكذلك فقدان الحياة. وسيفتح الحل المقترح الباب أمام إجراء المزيد من الفحوصات في هذا المجال، بما في ذلك التحقق من المؤشرات البيولوجية المحتملة المحددة وتحسين النتائج العلاجية في مجال زراعة الأعضاء.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم الدراسة من قبل منحة Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 من المركز الوطني للعلوم. ويود المؤلفون أن يعترفون بميليبور سيجما، وهي شركة تجارية من شركة ميرك كغا، دارمشتات، ألمانيا لتوفير أجهزة SPME. تعمل شركة ميرك في مجال علوم الحياة في الولايات المتحدة وكندا. أيضا ، والكتاب يريدون أن أشكر الحرارة فيشر العلمية للوصول إلى Q – Exactive التركيز على مطياف الكتلة المدارية. ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتورة ألكسندرا وودرسكا-جاسينسكا وموظفي قسم زراعة الأعضاء والجراحة العامة في بيدغوستس على مساعدتهم الكريمة في المشروع. BB تريد أن تشكر البروفيسور جانوش باوليسزين على فرصة جمع العينات في مستشفى تورنتو العام خلال إقامتها في جامعة واترلو.
Materials
| Acetic acid | Merck | 5330010050 | Mobile phase additive |
| Acetonitrile | Alchem | 696-34967-4X2.5L | HPLC solvent |
| Ammonium acetate | Merck | 5330040050 | Mobile phase additive |
| BENCHMIXER XL MULTI-TUBE VORTEXER | Benchmark Scientific | BV1010 | Vortex mixer |
| Caps | Perlan Technologies | 5183-2076 | Blue scrw tp, pre-slit PTFE/Si spta, 100PK |
| Chloroform | Merck | 1024441000 | |
| Discovery HS F5 Supelguard Cartridge, 3 μm, L × I.D. 2 cm × 2.1 mm | Merck | 567570-U | HPLC guard column |
| Discovery HS F5, 2.1 mm x 100 mm, 3 μm | Merck | 567502-U | HPLC column |
| Formic acid | Alchem | 497-94318-50ML | Mobile phase additive |
| Glass vials | Perlan Technologies | 5182-0714 | |
| HILIC Luna 3 μm, 200A, 100 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-00D-4449-B0 | HPLC column |
| HILIC SecurityGuard Cartridge, 3 μm, 4 x 2.0 mm | Shim-Pol | PHX-AJ0-8328 | HPLC guard column |
| Isopropanol | Alchem | 231-AL03262500 | HPLC solvent |
| Methanol | Alchem | 696-34966-4X2.5L | HPLC solvent |
| Nano-pure water | Merck | 1037281002 | HPLC solvent |
| Q Exactive Focus hybrid quadrupole-Orbitrap MS | Thermo Scientific | Q Exactive Focus | Mass Spectrometer |
| SeQuant ZIC-cHILIC 3µm,100Å 100 x 2.1 mm | Merck | 1506570001 | HPLC column |
| SeQuant ZIC-HILIC Guard Kit 20 x 2.1 mm | Merck | 1504360001 | HPLC guard column |
| SPME LC fiber probes, mixed mode | Supelco | prototype fibers | |
| UltiMate 3000 HPLC systems | Thermo Scientific | UltiMate 3000 | HPLC system |
| Vial inserts (deactivated) | Perlan Technologies | 5181-8872 | |
| XSelect CSH C18 3.5μm 2.1x75mm | Waters | 186005644 | HPLC column |
| XSelect CSH C18 VanGuard Cartridge 3.5μm, 2.1x5mm | Waters | 186007811 | HPLC guard column |
Riferimenti
- . Organ Procurement and Transplantation Network Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov (2019)
- Branger, P., Undine, S. . Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation. , (2018).
- Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers. Transplantation. 97, 797-807 (2014).
- Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation. Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).
- Xu, J., et al. Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction. Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).
- Rao, S., et al. Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).
- Wishart, D. S. Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation. American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).
- Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. Understanding metabolomics in biomedical research. Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).
- Bojko, B., et al. Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols. Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).
- Filipiak, W., Bojko, B. SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research – How far are we from daily practice. TrAC – Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).
- Bojko, B., et al. Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery. Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).
- Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).
- Plattner, B. W., et al. Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques. Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).
- Tapia-Canelas, C., et al. Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients. Nefrologia. 34, 115-119 (2014).
- Afshinnia, F., et al. Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease. Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).
- Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. Lipidomics: New insight into kidney disease. Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).
- Kaminski, J., et al. Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation. Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).
- Wijermars, L. G. M., et al. Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function. Kidney International. 90, 181-191 (2016).
- Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).
- Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury. PLoS One. 13, 1-24 (2018).
- Wishart, D. S. Metabolomics in monitoring kidney transplants. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).
- Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases. Metabolites. 9, (2019).
- Zhang, Z. H., et al. Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis. Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).
- Looby, N. T., et al. Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring. Analyst. 144, 3721-3728 (2019).
- Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS. Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).
