휴대용 qPCR 시스템을 이용한 마이트리카리아 샤모말라의 현장 식별
Summary
여기에 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 Matricaria chamomilla의 현장 식별을위한 프로토콜이 여기에 제시된다. 이 수행하기 쉬운 프로토콜은 농장이나 창고와 같이 실험실 장비 및 전문 지식에 대한 액세스가 제한된 위치에서 식물 종의 신원을 확인하는 방법으로 이상적입니다.
Abstract
식물 제품의 품질 관리는 원료 공급에서 시작됩니다. 전통적으로 식물 성 식별은 형태학적 평가 및 화학 분석 방법을 통해 수행됩니다. 그러나, 식물학자의 가용성의 부족, 특히 최근 몇 년 동안, 소비자 수요와 기후 변화 증가에 의해 가져온 공급망의 스트레스에 대처하기 위해 품질 관리를 강화 할 필요성과 함께, 대체 접근 이 필요합니다. 이 프로토콜의 목표는 실험실 장비 및 전문 지식에 대한 접근이 제한된 현장 또는 모든 환경에서 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 식물 종 식별을 용이하게하는 것입니다. 표적 DNA는 염료 계 qPCR을 사용하여 증폭되며, DNA는 식물 성 기준 물질에서 추출되어 양성 대조군으로 사용됩니다. 표적 DNA는 그것의 특정 증폭및 양성 통제에 대하여 그것의 융피크를 일치시킴으로써 확인됩니다. 실습 필드 샘플 수집에서 DNA 추출, PCR 증폭, 데이터 해석에 이어 독자가 이 프로토콜을 복제할 수 있도록 단계 및 매개 변수에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. 생성된 결과는 기존의 실험실 식물 식별 방법과 일치합니다. 이 프로토콜은 쉽게 수행하고 비용 효율적이며, 가능한 한 공급망의 원산지에 가까운 원료에 대한 품질 테스트를 가능하게 합니다.
Introduction
건강을 유지하고 개선하기 위해 식물을 사용하는 관행은 수천 년으로 거슬러 올라갑니다. 소비자 수요 증가에 따른 공급망의 스트레스1,지속불가능한 수확 관행 및 기후 변화2,식물성 변속기는 식품 및 건강 보조 식품 산업3에서점점 더 커지고 있습니다. 선언되지 않거나 잘못 식별된 식물 종의 존재는 효능 감소 또는 안전 문제로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 흑코호시(Actaearacemosa)는월경전 불편함 을 치료하는 데 사용되며, 효능에 대한 제한된 임상 데이터 지원을 가진 저가 아시아 종으로 대체될 수있다. 더 심각한 경우, 중국 허브를 이용한 체중 감량을 위한 임상 연구에서 스테파니아 테랑드라를 위한 아리스토로키아 팡치를 대체하여 일부참가자의심각한 신장 독성 및 신부전으로 이어졌다5,6. 두 종은 중국의 공통이름 “팡지”를 공유했습니다. 이러한 경우 는 원료 의 식별으로 시작하여 보다 엄격한 품질 관리의 필요성을강조7,바람직하게는 가능한 한 공급망의 원산지점에 가깝기 때문에 자원이 올바른 정체성의 물질에 효율적으로 할당될 수 있다.
식물 성 식별에 사용할 수있는 여러 직교 접근법을 사용할 수 있습니다. 전통적으로 식물성 식별은 형태학적 평가8,,9 및 화학 분석방법(10,11, 12,,12,13)을통해 수행됩니다., 형태학적 식별은 차이가 있는 경우 식물 물질의 거시적 및 현미경 기능의 차이를 기반으로합니다(그림 1). 그러나, 최근 몇 년 동안 고전 식물학에 교육 프로그램의 부족은 전문가의 부족을 초래하고있다14,일상적인 품질 관리에 대한 이 접근 방식을 비현실적으로 만들기. 분말 식물 재료의 적용도 제한적입니다. 화학 적 분석 방법은 약전 및 실험실에서 널리 사용되지만 고성능 씬 층 크로마토그래피 (HPTLC), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 핵 자기 공명 분광법 (그림2)및 환경 요구 사항과 같은 계측기의 크기로 인해 현장 테스트에 적합하지 않습니다. 최근에는 유전체학적 방법이 식물종의 인증 및 대체 검출을 위한 대체 기술로 부상하고 있으며 효율적이고 정밀한 것으로 입증되었습니다. 유전체학적 방법은,,,식물물질(15,16,17,18, 19)에서유전정보의 높은 충실도 및 특이성을 이용한다.,19 분자 진단 도구는 휴대용 장치의 형태로 사용할 수 있으며 종종 기술 사용 장벽을 낮추는 자동화 된 데이터 해석 도구를 포함하므로이 접근 방식은20,,21,,22,,23,,24에이상적입니다. 분자 분석 방법이설계되고 검증되면 25,,26,,27,기본 분자 생물학 훈련을 가진 모든 인력에 의해 수행될 수 있다. 사용 가능한 다양한 휴대용 도구 중, DNA 서열에 실시간 PCR은 비용 효율적인 선택 중 하나입니다(28). 휴대용 장치의 조합은 맞춤형 분자 분석과 함께 농장 및 식물 재료 창고와 같은 실험실 외부의 식물 종 및 성분을 검증하여 기존의 방법과 관련된 시간과 비용을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜의 목표는 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 실험실 장비 및 전문 지식에 대한 액세스가 제한되거나 사용할 수 없는 상황에서 식물 식별 방법을 도입하는 것입니다. 이 방법은 일반적으로 독일 카모마일로 알려진 Matricaria chamomilla (그림 3A)의분야에서 입증되며, 항 염증 및 항산화특성(29)에널리 사용된다. 특히 제네라 차마메룸, 타나세툼, 국화30,30,31,32로부터유사한 외관이나냄새의관련 종과 혼동될 수 있다. 관련 종 중, Chamaemelum nobile,또한 로마 카모마일로 알려진, 상거래에서 비교 생산 수준을 가진 눈에 띄는 하나입니다(그림 3B). 입증된 방법은 표적 식물종 M. 샤모멜라를식별할 뿐만 아니라 DNA 서열의 특정 증폭을 기반으로 가까운 친척 C. nobile를검출하도록 설계되었습니다.
이 문서에서는 염료 기반 qPCR을 상호 교화하고 휴대용 장치에서 곡선 분석을 용융하여 M. 샤모마리야의 현장 식물 식별을 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 현장에서 식물 성 샘플 의 수집, 현장 DNA 추출 및 실시간 PCR 반응 설정이 포함됩니다. 유효한 결론을 보장하기 위해, 표적 식물 M. chamomilla 및 비 표적 식물 C. 노빌레 게놈 DNA, 인증된 식물 참조 물질에서 미리 추출된, 양성 대조군으로 이용된다. 이 방법의 특이성은 샘플 및 컨트롤에 대한 M. 샤모말라 및 C. nobile 식별 테스트를 개별적으로 수행하여 입증됩니다. 비템플릿 음성 제어는 PCR 오염으로 인한 거짓 긍정 결과를 제외하는 데 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프라이머 와 템플릿 선택의 디자인은 효율적이고 구체적인 qPCR 증폭을 얻는 중요한 단계입니다. 적절한 템플릿을 식별한 후 프라이머 설계 소프트웨어는 일반적으로 프라이머 길이, 용융 온도 및 GC함량(33,,34)과같은 설계 변수를 기반으로 프라이머 선택을 돕기 위해 사용됩니다. 최적화 및 유효성 검사는 PCR반응(35)의특이성, 감도 및 견고성을 보장하기 위해 분석의 예상 실험 조건하에서 수행될 수 있다. 최적 프라이머 설계는 프라이머-디머 형성을 초래할 수 있으며, 여기서 프라이머 상호 작용은 비특이적제품(36)을생성한다.
이 연구에서 사용되는 템플릿 컨트롤(NTC)은 DNA 오염과 분석에 영향을 줄 수 있는 프라이머-디머의 존재를 검사합니다. 결과는 증폭이 없음을 보여주었습니다, DNA 오염과 프라이머 디머 둘 다 관심사가 아니라는 것을 좋은 표시. DNA 오염 및 프라이머 디머는 템플릿 컨트롤을 통해 용융 곡선에 명시되며 양극 컨트롤의 용융 곡선의 추가 피크로 나타납니다. 일반적으로 템플릿의 AT가 풍부한 하위 도메인이 고르지 않은 용융을 일으키지 않는 한 양수 컨트롤의 용융 곡선은 단일 피크를 포함할 것으로 예상됩니다. uMELT소프트웨어(37)를사용하여 용융 분석체를 시뮬레이션하여 이중 피크를 예측할 수 있습니다. 본 연구에서는 아가로즈 젤에서 PCR 제품을 실행하는 금본위제는 표적 PCR 제품의 존재와 오염 및 프라이머-디머의 부재를 확인하는 데 사용되었습니다.
식물성 물질 분자 분석에서 상당한 과제는 식물 DNA 추출 과정에 따라 양질의 DNA를 얻는 것입니다. 식물 성 물질은 건강 상의 이점과 관련된 활성 화학 화합물에 대해 거래되고 소비됩니다. DNA 추출 과정에서 이러한 화학 화합물은 DNA 추출 용액으로 방출되어 잠재적으로 PCR 억제를 일으켜 PCR 증폭에 실패하게 됩니다. 유기 용매및 컬럼을 이용한 다양한 식물 DNA 정제 키트가 개발되어식물성(38)에서유래한 화학화합물을 제거하였다. 그러나 이러한 키트를 지원하는 데 필요한 연기 후드와 고속 원심분리기는 현장에서 사용할 수 없습니다.
현재 프로토콜에서, 단순화된 DNA 추출 방법은 상업용 식물 DNA 추출 키트를 사용합니다(자세한 내용은 재료표 참조). 그것은 재현 가능한 결과에 대 한 일반적인 억제 물질을 중화 하는 능력을 했다 M. chamomilla와 C. nobile에 대 한 일관 된 결과 생산. M. 샤모멜라와 C. 노빌꽃 머리와 잎은 PCR 억제제의 존재가 문제가 되지 않았다는 것을 나타내는 특정 용융 봉우리와 PCR 앰플리콘을 산출했다. PCR 억제제의 상부를 가진 그밖 식물에 대 한, 그들의 원래 추출에 DNA 증폭 덜 효율적 일 수 있습니다. 억제를 줄이고 증폭 효율을 향상시키기 위해 전체 식물에 대한 액세스와 함께, 낮은 다당류 및 폴리페놀 함량을 가진 다른 식물 부품도 식별 목적으로 사용될 수 있습니다. 다른 식물 부품에 대한 제한된 액세스가있는 경우, 일반적으로 낮은 페놀 함량(39)을가지고 꽃 머리에서 해부 젊은 잎이나 꽃잎, 성공의 더 나은 기회를 제공 할 수 있습니다. DNA 서열은 전체 식물에 걸쳐 일관되기 때문에, 어떤 식물 부분은 종 정체성을 확인하기 위하여 이용될 수 있습니다. PCR 증폭이 여전히 최적이 아닌 경우, 원래 DNA 추출물은 PCR 전에 더 희석될 수 있거나, 보다 정교한 실험실 정화 프로토콜을 사용할 수 있다.
PCR 분석을 위한 또 다른 과제는 DNA 오염에 기인한 거짓 양성 결과입니다, 이는 데이터 해석에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 그것은 일반적으로 적극적인 하우스 키핑에 의해 제어, 전용 장비를 사용 하 여, 지정된 영역에 작업을 제한. qPCR을 사용하면 모든 PCR 분석을 폐쇄 된 시스템에서 수행 할 수 있어 잘 제어되지 않는 환경에서 PCR 앰플리턴 오염의 가능성을 크게 줄입니다. 게다가, 환경 DNA는 또한 이전 검증 연구40에따라 분석의 특이성 때문에 거짓 긍정을 표시해서는 안됩니다.
개선의 여지가 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜에서, 상호 확장염은 실시간으로 표적 단편 증폭을 보여주기 위하여 이용되었습니다. 방법의 특이성은 M. 샤모멜라와 C. 노빌앰플리콘 사이에 구별되는 특징적인 용융 온도에 의해 더욱 확인된다. 따라서 염료 기반 PCR을 교화하면 현장에서 “이 식물 종은 무엇입니까?” 라는 질문에 효율적으로 대답할 수 있습니다. 그러나 현장에서 격리된 단일 플랜트에서 식물 성 식별을 수행해야 하는 것 외에도 많은 상황에서 창고의 식물 분말 또는 추출물도 현장 신속한 신원 평가를 통해 혜택을 누릴 수 있습니다. 이러한 유형의 재료에 대해 “이 물질에 무엇이 있는가?”, “내가 찾고 있는 식물종을 포함하고 있습니까?”, “피하고 싶은 간음이 포함되어 있습니까?”, “유해한 다른 식물종에 의해 전부 또는 부분적으로 대체됩니까?” 와 같은 추가 질문이 해결되어야 할 수 있습니다. 서로 다른 qPCR 프로브는 상호 연관염료를 사용하는 대신, 분석의 높은 특이성과 효율성을 유지하면서 한 반응 시스템에서 다른 식물의 앰플리콘을 대상으로 설계될 수 있습니다. 프로브 기반 qPCR의 개발과 다중 채널 감지기능을 제공하는 휴대용 qPCR 시스템의 활용은 식물 재료 창고 및 유통 센터와 같은 광범위한 환경 설정에 대한 목적에 맞는 분석으로 현장 테스트의 적용을 더욱 확장할 수 있습니다. 또한, 다중 프로브를 사용하면 사용자가 각 반응 시스템에 내부 증폭을 포함할 수 있으므로 PCR 억제가 의심되는 경우 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 동일한 목적으로 사용되는 기존 기술에 비해 다음과 같은 장점이 있습니다. 첫째, 전통적인 형태학적 및 화학적 식별 방법의 경우, 절차와 그 결과는 전문가에 의해 수행되고 해석되어야 합니다. qPCR 기반 식별 테스트는 기본적인 분자 생물학 훈련을 가진 사람들에 의해 수행되고 보다 표준화된 방식으로 해석될 수 있습니다. 둘째, 실험실에서 일반적으로 수행되는 qPCR 기반 종 식별 및 분화에 비해 휴대용 계측기를 사용하는 현장 식별 프로토콜은 고속 원심분리기, DNA 품질 평가 장비, 형광 검출기가 있는 열 사이클러 및 특수 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터와 같은 큰 발자국을 가진 계측기를 필요로 하지 않습니다. 따라서, DNA 기반 종 식별은 지체 없이 어떤 환경에서도 수행될 수 있다. 셋째, 식물 성 물질을 검색하는 것은 글로벌 작업이 필요한 작업입니다. 클라우드 서비스와 인공 지능의 발전과 함께 휴대용 장치는 실험실 의 전문가가 개발하고 검증하는 방법을 잠재적으로 수신하고 원격 지역의 전문가가 운영하며 제3자로부터 객관적인 인증을 생성할 수 있습니다. 따라서 이 옵션은 원격 작업이 추세가 되는 그 어느 때보다 도드라지않습니다.
요약하자면, 여기서 프로토콜은 휴대용 qPCR 시스템을 사용하여 M. 샤모말라의 현장 식별을 입증했다. 이 기술을 성공적으로 적용하면 식물 식별에 대한 매우 정확한 결과를 생성하고 식물 제조업체와 공급업체가 적시에 비용 효율적인 방식으로 식물 물질을 검증하는 데 도움이 됩니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
제임스 샨이 현장 비디오 녹화에 참여해 주신 것에 감사드립니다. 존 바이런과 매튜 세메로가 비디오 편집작업을 해주셔서 감사합니다. 안센 루오, 해리 듀, 프랭크 덩이 시험장 찾기에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 전체 원고에 대한 그녀의 귀중한 의견에 대한 마리아 루빈스키 감사합니다. 인정된 모든 사람은 허벌라이프 인터내셔널 오브 아메리카, Inc.의 직원입니다.
Materials
| Battery | TNE | 78000mAh | Provide field power supply |
| bCUBE | HYRIS | bCUBE 2.0 | Portable qPCR instrument |
| Cartridges(16 Well) | HYRIS | NA | Consumables for bCUBE |
| Electric pipette | Eppendorf | NA | Handling liquid |
| Extract-N-AmpTM plant PCR kit | SIGMA | XNAP2-1KT | Plant DNA extraction kit |
| German chamomile (Matricaria chamomilla L) flower botanical reference materials | AHP | 2264 | Used as positive control |
| Mini dry bath | Yooning | MiniH-100L | For DNA extraction |
| Nuclease-free water | AMBION | AM9937 | qPCR reaction |
| Primer | Thermo Fisher Scientific | NA | qPCR reaction |
| Roman chamomile (Chamaemelum nobile) flower botancial reference materials | ChromaDex | ASB-00030806-005 | Used as positive control |
| Luna universal qPCR master mix | NEB | M3003L | qPCR reaction |
Riferimenti
- Smith, T., Gillespie, M., Eckl, V., Knepper, J., Reynolds, C. Herbal supplement sales in US increase by 9.4% in 2018. HerbalGram. 123, 62-73 (2019).
- Israelsen, L. D. The challenge of regulation, globalization and climate change on botanicals and traditional medicines: respecting tradition while embracing change. Planta Medica. 74 (3), 36 (2008).
- Cardellina, J. H. Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry. Journal of Natural Products. 65 (7), 1073-1084 (2002).
- Foster, S. Exploring the peripatetic maze of black cohosh adulteration: a review of the nomenclature, distribution, chemistry, market status, analytical methods and safety. HerbalGram. 98, 32-51 (2013).
- Vanherweghem, J. L. Misuse of herbal remedies: The case of an outbreak of terminal renal failure in Belgium (Chinese herbs nephropathy). The Journal of Alternative and Complementary Medicine. 4 (1), 9-13 (1998).
- Vanherweghem, J. L., et al. Rapidly progressive interstitial renal fibrosis in young women: association with slimming regimen including Chinese herbs. The Lancet. 341 (8842), 387-391 (1993).
- Khan, I. A., Smillie, T. Implementing a “quality by design” approach to assure the safety and integrity of botanical dietary supplements. Journal of Natural Products. 75 (9), 1665-1673 (2012).
- Applequist, W. . The Identification of Medicinal Plants: A Handbook of the Morphology of Botanicals in Commerce. , (2006).
- Upton, R., Graff, A., Jolliffe, G., Länger, R., Williamson, E. . American Herbal Pharmacopoeia: Botanical Pharmacognosy – Microscopic Characterization of Botanical Medicines. , (2016).
- Frommenwiler, D. A., et al. Comprehensive HPTLC fingerprinting for quality control of an herbal drug – the case of angelica gigas root. Planta Medica. 84 (6-7), 465-474 (2018).
- Heyman, H. M., Meyer, J. J. M. NMR-based metabolomics as a quality control tool for herbal products. South African Journal of Botany. 82, 21-32 (2012).
- Lazarowych, N. J., Pekos, P. Use of fingerprinting and marker compounds for identification and standardization of botanical drugs: strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products. Drug Information Journal. 32 (2), 497-512 (1998).
- Tankeu, S., et al. Hyperspectral imaging and support vector machine: a powerful combination to differentiate black cohosh (actaea racemosa) from other cohosh species. Planta Medica. 84 (6-7), 407-419 (2018).
- Rodman, J. E., Cody, J. H. The taxonomic impediment overcome: NSF’s Partnerships for Enhancing Expertise in Taxonomy (PEET) as a model. Systematic Biology. 52 (3), 428-435 (2003).
- Chen, S., et al. A renaissance in herbal medicine identification: from morphology to DNA. Biotechnology Advances. 32 (7), 1237-1244 (2014).
- Li, X., et al. Plant DNA barcoding: from gene to genome. Biological Reviews. 90 (1), 157-166 (2015).
- Madesis, P., Ganopoulos, I., Sakaridis, I., Argiriou, A., Tsaftaris, A. Advances of DNA-based methods for tracing the botanical origin of food products. Food Research International. 60, 163-172 (2014).
- Newmaster, S. G., Ragupathy, S., Janovec, J. A botanical renaissance: state-of-the-art DNA bar coding facilitates an automated identification technology system for plants. International Journal of Computer Applications in Technology. 35 (1), 50-60 (2009).
- Parveen, I., Gafner, S., Techen, N., Murch, S. J., Khan, I. A. DNA barcoding for the identification of botanicals in herbal medicine and dietary supplements: strengths and limitations. Planta Medica. 82 (14), 1225-1235 (2016).
- Agrawal, N., Hassan, Y. A., Ugaz, V. M. A pocket-sized convective PCR thermocycler. Angewandte Chemie International Edition. 46 (23), 4316-4319 (2007).
- Almassian, D. R., Cockrell, L. M., Nelson, W. M. Portable nucleic acid thermocyclers. Chemical Society Reviews. 42 (22), 8769-8798 (2013).
- Benítez-Páez, A., Portune, K. J., Sanz, Y. Species-level resolution of 16S rRNA gene amplicons sequenced through the MinION portable nanopore sequencer. Gigascience. 5 (1), 4 (2016).
- Emanuel, P. A., et al. Detection of Francisella tularensis within infected mouse tissues by using a hand-held PCR thermocycler. Journal of Clinical Microbiology. 41 (2), 689-693 (2003).
- Quick, J., et al. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228 (2016).
- Lu, Z., et al. Single-laboratory validation of a two-tiered DNA barcoding method for raw botanical identification. Journal of AOAC International. 102 (5), 1435-1447 (2019).
- Sgamma, T., et al. DNA barcoding for industrial quality assurance. Planta Medica. 83 (14-15), 1117-1129 (2017).
- Wallinger, C., et al. Rapid plant identification using species-and group-specific primers targeting chloroplast DNA. PLoS One. 7 (1), 29473 (2012).
- Newmaster, S. G., et al. Recommendations for validation of real-time PCR methods for molecular diagnostic identification of botanicals. Journal of AOAC International. , (2019).
- Singh, O., Khanam, Z., Misra, N., Srivastava, M. K. Chamomile (Matricaria chamomilla L.): an overview. Pharmacognosy Reviews. 5 (9), 82 (2011).
- Mills, S. Y., Bone, K. The Essential Guide to Herbal Safety. Elsevier Health Sciences. , 325 (2004).
- Avula, B., et al. Quantitative determination of phenolic compounds by UHPLC-UV-MS and use of partial least-square discriminant analysis to differentiate chemo-types of Chamomile/Chrysanthemum flower heads. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 278-288 (2014).
- Guzelmeric, E., Vovk, I., Yesilada, E. Development and validation of an HPTLC method for apigenin 7-O-glucoside in chamomile flowers and its application for fingerprint discrimination of chamomile-like materials. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 107, 108-118 (2015).
- Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., Dveksler, G. S. General concepts for PCR primer design. Genome Research. 3 (3), 30-37 (1993).
- Untergasser, A., et al. Primer3Plus, an enhanced web interface to Primer3. Nucleic Acids Research. 35, 71-74 (2007).
- Bustin, S., Huggett, J. qPCR primer design revisited. Biomolecular Detection and Quantification. 14, 19-28 (2017).
- Brownie, J., et al. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Research. 25 (16), 3235-3241 (1997).
- Dwight, Z., Palais, R., Wittwer, C. T. uMELT: prediction of high-resolution melting curves and dynamic melting profiles of PCR products in a rich web application. Bioinformatics. 27 (7), 1019-1020 (2011).
- Heikrujam, J., Kishor, R., Mazumder, P. B. The chemistry behind plant DNA isolation protocols. Biochemical Analysis Tools – Methods for Bio-Molecules Studies. , (2020).
- Blum-Silva, C. H., Chaves, V. C., Schenkel, E. P., Coelho, G. C., Reginatto, F. H. The influence of leaf age on methylxanthines, total phenolic content, and free radical scavenging capacity of Ilex paraguariensis aqueous extracts. Revista Brasileira de Farmacognosia. 25 (1), 1-6 (2015).
- Lu, Z., et al. Validation of a targeted PCR method for raw and processed botanical material identification: an example using matricaria chamomilla (chamomile). Journal of AOAC International. 102 (6), 1787-1797 (2019).
