Isolatie van tonsillaire mononucleaire cellen om ex vivo ingeboren immuunreacties te bestuderen in een menselijk mucosale lymfoïde weefsel
Summary
In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen van gezonde mensen verwerken en kweken die gedeeltelijke chirurgische tonsillectomie ondergaan om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in mucosale weefsels nabootst.
Abstract
Het bestuderen van geïsoleerde cellen uit slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) maakt het mogelijk om de respons van immuuncellen in pathologieën met mucosale immuniteit te begrijpen, omdat ze gastheerpathogenische interacties in het weefsel kunnen modelleren. Terwijl geïsoleerde cellen afkomstig van weefsels waren de eerste cel cultuur model, het gebruik ervan is verwaarloosd omdat weefsel kan moeilijk te verkrijgen. In het huidige protocol leggen we uit hoe je gemakkelijk tonsillar mononucleaire cellen (TMC’s) verwerken en kweken van gezonde menselijke amandelen om aangeboren immuunreacties bij activering te bestuderen, waarbij virale infectie in slijmvliesweefsels nabootst. Isolatie van TMC’s uit de amandelen is snel, omdat de amandelen nauwelijks epitheel hebben en tot miljarden van alle grote immuunceltypes opleveren. Deze methode maakt detectie van cytokine productie met behulp van verschillende technieken, waaronder immunoassays, qPCR, microscopie, flow cytometrie, enz., vergelijkbaar met het gebruik van perifere mononucleaire cellen (PBMCs) uit bloed. Bovendien vertonen TMC’s een hogere gevoeligheid voor geneesmiddelentests dan PBMCs, waarmee rekening moet worden gehouden met toekomstige toxiciteitstests. Ex vivo TMC-culturen zijn dus een eenvoudig en toegankelijk slijmvliesmodel.
Introduction
Studies over menselijke organen zijn beperkt als gevolg van toegankelijkheid en voor de hand liggende ethische redenen. Ze zijn echter essentieel om de complexiteit van de menselijke biologie volledig te begrijpen. Culturen van geïsoleerde cellen (primaire culturen of cellijnen) zijn een standaardsysteem in celbiologiestudies vanwege hun beschikbaarheid. Terwijl geïsoleerde celculturen hebben toegestaan uitstekende ontdekkingen, het gebruik van cellijnen is gekomen op nadere toetsing, omdat ze niet volledig na te bootsen in vivo orgaanbiologie. De cultuur van driedimensionale cellen of weefselexplants is echter zeer complex4,5,6. Inderdaad, een stuk weefsel of orgaan is zeer heterogeen omdat de celsamenstelling verschilt afhankelijk van de lokalisatie in het weefsel. Dus, het gebruik van weefselblokken vereist de analyse van vele technische en biologische replicaties, wat leidt tot de noodzaak van een groot aantal donoren of patiënten.
De slijmvlies-geassocieerde lymfoïde weefsels (MALT) zijn structureel vergelijkbaar met de lymfeklieren, maar hebben unieke functies, omdat hun belangrijkste rol is het reguleren van slijmvliesimmuniteit7. In tegenstelling tot de lymfeklieren, die zich meestal op enige afstand van de weefsels bevinden, bevindt MALT zich over het algemeen direct onder het epitheel van het slijmvliesweefsel. Histologisch gezien bestaan ze voornamelijk uit hoge concentraties B- en T-cellen, maar ook antigeen-presenterende cellen zoals macrofagen en dendritische cellen. MOUT vormen ongeveer 50% van het lymfeweefsel in het menselijk lichaam. Mout is onderverdeeld in negen groepen, afhankelijk van hun locatie: GALT (gut-), BALT (bronchus-), NALT (nasale-), CALT (conjunctival), LALT (larynx-), SALT (skin-), VALT (vulvo-), O-MALT (georganiseerd) en D-MALT (diffuus). De O-MALT bestaat voornamelijk uit de amandelen van Waldeyer’s tonsillaire ring en is de meest toegankelijke MALT8,9. Inderdaad, amandelen in de oropharynx vormen de belangrijkste barrière ter bescherming van de spijsvertering en luchtwegen tegen (potentiële) invasieve micro-organismen10. Bovendien worden de amandelen bedekt met een fijne gelaagde plaveisel niet-keratiniserend epitheel, ondersteund door een capsule bindweefsel dat bloedvaten, zenuwen en lymfotica bevat, waardoor gemakkelijk toegang is tot de immuuncellen11,12. Bovendien is tonsillectomie, de chirurgische handeling van het verwijderen van amandelen, een veel voorkomende procedure uitgevoerd bij kinderen met slaapstoornissen ademhaling, waardoor amandelen een gemakkelijk beschikbaar weefsel13 in fysiologische instellingen.
Tonsils maken de studie van immuuncelrespons in pathologieën met betrekking tot mucosale immuniteit mogelijk. Inderdaad, bij hiv-infectie, omdat amandelen zijn samengesteld uit een hoge concentratie van immuuncellen, ze zijn het belangrijkste doelwit van virale replicatie, maar produceren ook een grote hoeveelheid cytokinen die niet worden gedetecteerd in de circulatie14,15. In stabiele toestanden zijn zeldzame populaties van aangeboren cellen aanwezig in verschillende slijmvliesweefsels, waaronder de amandelen, maar zijn in wezen afwezig in bloed.
Mononucleaire cellen uit amandelen (TMC’s) zijn dus een relevanter en complexer model dan PBMC’s en kunnen diepgaandere vragen beantwoorden. Aan de andere kant kan het gebruik van weefselexplants complex zijn en niet altijd relevant voor aangeboren immuunstudies. Zo hebben we een model opgesteld om mucosale immuunactivering te bestuderen met behulp van TMC’s16. Hier beschrijven we een methode voor een efficiënte isolatie van TMC’s van verse menselijke amandelen. Deze methode maakt het herstel van een groot aantal immuuncellen mogelijk terwijl hun integriteit behouden blijft voor ex vivo-studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Menselijke amandelen vertegenwoordigen een integratief en fysiologisch ex vivo-model om aangeboren immuunreacties te bestuderen op de slijmkoselsinterface, omdat ze de rol van een secundair lymfoïde orgaan nabootsen. Interessant is dat de cellulaire samenstelling van de TMC’s vergelijkbaar is met de PBMCs en alle grote celpopulaties omvat, hoewel hun percentage kan verschillen van PBMCs van bloed(figuur 1). Extra populaties kunnen ook worden gevonden, omdat alle immuunreacties worden geïni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) voor de experimenten en N.B. fellowship (AAP 2017 166). N.S. erkent steun van de ANRS for fellowship (AAP 2016 1), de European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), het startup funding programma “Baustein” van de Medische Faculteit van de Universiteit van de Universiteit van de Universiteit (LSBN.0147) en de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/11).
Materials
| 10 meshes steel grid – 1910 µm | Dutscher | 198586 | To put in the cell strainer Cellector |
| 60 meshes steel grid – 230 µm | Dutscher | 198591 | To put in the cell strainer Cellector |
| 70 µm white ClearLine cell strainers | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D detergent | Dutscher | 59852 | Detergent |
| Antibiotic solution, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium and 100 μg/mL Streptomycin – to add to culture media |
| BD FalconTM Round-Bottom Tubes, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Tubes |
| Cell strainer Cellector, 85 mL and 37 mm diameter | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7572 | Viability assay |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Conical tubes Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Curved tweezers | Dutscher | 711200 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium and magnesium |
| EnVision | PerkinElmer | Measures the luminescence | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | To add to culture media | ||
| Fluorescence labeles antibodies | See Table 1 | ||
| Glass Pestle | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1M) | Thermo Fisher | 15630056 | Use at 20 mM |
| Incubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-based immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Density gradient medium |
| Mr. Frosty container | Thermo Fisher | 5100-0001 | Slow freezing container |
| Pierce 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Cell Culture Dish, 150 x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Surgical blade sterile N°23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | To make wash buffer in PBS |
Riferimenti
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix. The Journal of Experimental Medicine. 97 (5), 695-710 (1953).
- Jones, H. W. Record of the first physician to see Henrietta Lacks at the Johns Hopkins Hospital: History of the beginning of the HeLa cell line. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 176 (6), s227-s228 (1997).
- Cummins, J. E., et al. Preclinical Testing of Candidate Topical Microbicides for Anti-Human Immunodeficiency Virus Type 1 Activity and Tissue Toxicity in a Human Cervical Explant Culture. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (5), 1770-1779 (2007).
- Abner, S. R., et al. A Human Colorectal Explant Culture to Evaluate Topical Microbicides for the Prevention of HIV Infection. The Journal of Infectious Diseases. 192 (9), 1545-1556 (2005).
- Introini, A., Vanpouille, C., Fitzgerald, W., Broliden, K., Margolis, L. Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture. Journal of Visualized Experiments. (140), e57013 (2018).
- Elmore, S. A. Enhanced Histopathology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 687 (2006).
- Strioga, M. M., Dobrovolskiene, N. T. Dendritic Cells as Targets of Vaccines and Adjuvants. Immunopotentiators in Modern Vaccines. , 43-64 (2017).
- Bachert, C., Möller, P. Die Tonsille als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) der Nasenschleimhaut. Laryngo-Rhino-Otologie. 69 (10), 515-520 (1990).
- Perry, M., Whyte, A. Immunology of the tonsils. Immunology Today. 19 (9), 414-421 (1998).
- Perry, M. E. The specialised structure of crypt epithelium in the human palatine tonsil and its functional significance. Journal of Anatomy. 185, 111-127 (1994).
- Cesta, M. F. Normal Structure, Function, and Histology of Mucosa-Associated Lymphoid Tissue. Toxicologic Pathology. 34 (5), 599-608 (2006).
- Kaditis, A. G., et al. Obstructive sleep disordered breathing in 2-to 18-year-old children: diagnosis and management TASK FORCE REPORT ERS STATEMENT. European Respiratory Journal. 47, 69-94 (2016).
- Herbeuval, J. P., et al. HAART reduces death ligand but not death receptors in lymphoid tissue of HIV-infected patients and simian immunodeficiency virus-infected macaques. AIDS. 23 (1), 35-40 (2009).
- Herbeuval, J. P., et al. Differential expression of IFN-alpha and TRAIL/DR5 in lymphoid tissue of progressor versus nonprogressor HIV-1-infected patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7000-7005 (2006).
- Smith, N., et al. Control of TLR7-mediated type I IFN signaling in pDCs through CXCR4 engagement-A new target for lupus treatment. Science Advances. 5 (7), eaav9019 (2019).
- Lucas-Hourani, M., et al. Inhibition of pyrimidine biosynthesis pathway suppresses viral growth through innate immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003678 (2013).
- Kleiveland, C. R. Peripheral Blood Mononuclear Cells. The Impact of Food Bioactives on Health. , 161-167 (2015).
- Ban, Y. L., Kong, B. H., Qu, X., Yang, Q. F., Ma, Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clinical and Experimental Immunology. 151 (3), 399-406 (2008).
- Papaioannou, G., et al. Age-Dependent Changes in the Size of Adenotonsillar Tissue in Childhood: Implications for Sleep-Disordered Breathing. The Journal of Pediatrics. 162 (2), 269-274 (2013).
