Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Os queratinócitos primários humanos derivados da pele humana são frequentemente usados como modelo celular para estudar a biologia da epiderme^1,2,3,4. A estratificação da epiderme pode ser modelada pela diferenciação de queratinócitos, seja de forma monocamada submersa 2D ou no modelo organotípico 3D air-lift^2,3,5,6,7. Embora os modelos 3D tenham se tornado cada vez mais importantes para avaliar a estrutura e a função epidérmica, os modelos de diferenciação 2D ainda são amplamente utilizados, devido à sua conveniência e à possibilidade de gerar um grande número de células para análises.

Várias condições têm sido aplicadas para induzir a diferenciação de queratinócitos em 2D, incluindo adição de soro, alta concentração de cálcio, menor temperatura e inibição dos receptores do fator de crescimento epidérmico^2,3. Cada um desses métodos foi validado por uma série de genes marcadores de diferenciação de queratinacitos e mostrou-se eficaz na avaliação da diferenciação de queratinócitos, inclusive em condições patológicas. No entanto, essas condições de indução também mostram diferenças em sua eficiência de diferenciação e cinética quando painéis específicos de genes marcadores são examinados^2,3.

Um desses métodos envolve a inibição do contato queratinócito e o esgotamento dos fatores de crescimento no meio da cultura⁸. Foi demonstrado que os queratinócitos podem se diferenciar espontaneamente quando as células atingem a densidade máxima.  A exclusão dos fatores de crescimento no meio da cultura pode aumentar ainda mais a diferenciação. O método que combina inibição de contato e esgotamento dos fatores de crescimento tem se mostrado para gerar queratinócitos diferenciados com padrões de expressão genética semelhantes à epiderme estratificada normal ao usar vários marcadores epidérmicos^3,sugerindo que este modelo é adequado para estudar a diferenciação normal de queratinócitos. Recentemente, duas análises abrangentes de expressão genética da diferenciação de queratinócitos utilizando este modelo foram^{relatadas 9,10}. Os pesquisadores validaram esse modelo a nível molecular e mostraram que ele pode ser usado para estudar a diferenciação normal e doente do queratinócito.

Este protocolo descreve o procedimento para o método de diferenciação in vitro e análise molecular de células diferenciadas usando RNA-seq. Também ilustra a caracterização do transcriptome das células no dia 0 de diferenciação (estágio de proliferação), dia 2, dia 4 e dia 7 (diferenciação precoce, média e tardia, respectivamente). É mostrado que que queratinócitos diferenciados exibem padrões de expressão genética que se assemelham em grande parte às células durante a estratificação epidérmica. Para examinar se esse método pode ser usado para estudar a patologia da pele, aplicamos o mesmo pipeline experimental e de análise para investigar queratinócitos portadores de mutações do fator de transcrição p63 derivados de pacientes com displasia ectodérmica e fissura/fissura (CEE)^{síndrome 11,12}. Este protocolo se concentra na diferenciação in vitro de queratinócitos, bem como na análise bioinformática subsequente do RNA-seq. Outras etapas do procedimento completo, como extração de RNA, preparação de amostras de RNA-seq e construção de biblioteca, são bem documentadas e podem ser facilmente seguidas, especialmente quando se usa muitos kits comerciais comumente usados. Portanto, essas etapas são descritas apenas brevemente no protocolo. Os dados mostram que este gasoduto é adequado para estudar eventos moleculares durante a diferenciação epidérmica em queratinócitos saudáveis e doentes.