Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse
Summary
Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.
Abstract
Menselijke primaire keratinocyten worden vaak gebruikt als in vitro modellen voor studies over epidermale differentiatie en aanverwante ziekten. Methoden zijn gemeld voor in vitro differentiatie van keratinocyten gekweekt in tweedimensionale (2D) ondergedompelde manieren met behulp van verschillende inductie voorwaarden. Hier beschreven is een procedure voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie methode door contactremming en latere moleculaire karakterisering door RNA-seq. Kortom, keratinocyten worden geteeld in gedefinieerd keratinocyten medium aangevuld met groeifactoren totdat ze volledig samenvloeien. Differentiatie wordt veroorzaakt door nauwe contacten tussen de keratinocyten en verder gestimuleerd door het uitsluiten van groeifactoren in het medium. Aan de hand van RNA-seq-analyses wordt aangetoond dat beide 1) gedifferentieerde keratinocyten verschillende moleculaire kenmerken vertonen tijdens differentiatie en 2) het dynamische genexpressiepatroon lijkt grotendeels op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Wat de vergelijking met normale keratinocyten differentiatie, keratinocyten dragen mutaties van de transcriptie factor p63 vertonen veranderde morfologie en moleculaire handtekeningen, in overeenstemming met hun differentiatie gebreken. Tot slot beschrijft dit protocol de stappen voor 2D in vitro keratinocyten differentiatie en de moleculaire karakterisering ervan, met de nadruk op bio-informatica analyse van RNA-seq gegevens. Omdat RNA extractie en RNA-seq procedures zijn goed gedocumenteerd, het is niet de focus van dit protocol. De experimentele procedure van in vitro keratinocyten differentiatie en bio-informatica analyse pijplijn kan worden gebruikt om moleculaire gebeurtenissen te bestuderen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.
Introduction
Menselijke primaire keratinocyten afgeleid van de menselijke huid worden vaak gebruikt als een cellulair model om de biologie van de opperhuid1,2,3,4te bestuderen . De gelaagdheid van de opperhuid kan worden gemodelleerd door keratinocyten differentiatie, hetzij in een 2D ondergedompeld monolayer mode of 3D lucht-lift organotypic model2,3,5,6,7. Hoewel 3D-modellen steeds belangrijker zijn geworden om de epidermale structuur en functie te beoordelen, worden 2D-differentiatiemodellen nog steeds veel gebruikt, vanwege hun gemak en de mogelijkheid om grote aantallen cellen voor analyses te genereren.
Er zijn verschillende voorwaarden toegepast voor het induceren van keratinocytendifferentiatie in 2D, waaronder toevoeging van serum, hoge concentratie calcium, lagere temperatuur en remming van epidermale groeifactorreceptoren2,3. Elk van deze methoden is gevalideerd door een aantal keratinocyten differentiatie marker genen en aangetoond effectief te zijn in de beoordeling van keratinocyten differentiatie, ook onder pathologische omstandigheden. Deze inductieomstandigheden vertonen echter ook verschillen in hun differentiatieefficiëntie en kinetiek wanneer specifieke panelen van markergenen worden onderzocht2,3.
Een van deze methoden omvat keratinocyten contactremming en uitputting van groeifactoren in het cultuurmedium8. Het is aangetoond dat keratinocyten spontaan kunnen differentiëren wanneer cellen de volledige dichtheid bereiken. Het uitsluiten van groeifactoren in het cultuurmedium kan de differentiatie verder verbeteren. De methode die contactremming combineert en groeifactoren uitputten, is aangetoond dat het gedifferentieerde keratinocyten genereert met genexpressiepatronen die vergelijkbaar zijn met de normale gestratificeerde opperhuid bij het gebruik van verschillende opperhuidmarkeringen3,wat suggereert dat dit model geschikt is voor het bestuderen van normale keratinocytendifferentiatie. Onlangs zijn twee uitgebreide genexpressieanalyses van keratinocytendifferentiatie gerapporteerd met behulp van dit model9,10. Onderzoekers valideerden dit model op moleculair niveau en toonden aan dat het kan worden gebruikt om normale en zieke keratinocytendifferentiatie te bestuderen.
Dit protocol beschrijft de procedure voor de in vitro differentiatie methode en moleculaire analyse van gedifferentieerde cellen met behulp van RNA-seq. Het illustreert ook karakterisering van de transcriptie van cellen op differentiatie dag 0 (proliferatie fase), dag 2, dag 4, en dag 7 (vroeg, midden, en late differentiatie, respectievelijk). Het is aangetoond dat gedifferentieerde keratinocyten genexpressiepatronen vertonen die grotendeels lijken op cellen tijdens epidermale gelaagdheid. Om te onderzoeken of deze methode kan worden gebruikt voor het bestuderen van huidpathologie, hebben we dezelfde experimentele en analysepijplijn toegepast om keratinocyten te onderzoeken die mutaties dragen van de transcriptiefactor p63 die zijn afgeleid van patiënten met ectrodactyly, ectodermal displasie en gespleten lip/gehemelte (EEG) syndroom11,12. Dit protocol richt zich op de in vitro differentiatie van keratinocyten en de daaropvolgende bio-informatica analyse van RNA-seq. Andere stappen in de volledige procedure, zoals RNA extractie, RNA-seq monster voorbereiding en bibliotheek bouw, zijn goed gedocumenteerd en kan gemakkelijk worden gevolgd, vooral bij het gebruik van vele veelgebruikte commerciële kits. Daarom worden deze stappen slechts kort beschreven in het protocol. De gegevens tonen aan dat deze pijpleiding geschikt is voor het bestuderen van moleculaire gebeurtenissen tijdens epidermale differentiatie in gezonde en zieke keratinocyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft een methode voor het induceren van menselijke keratinocyten differentiatie en de daaropvolgende karakterisering met behulp van RNA-seq analyses. In de huidige literatuur gebruiken veel studies over menselijke keratinocytendifferentiatie twee andere methoden, met een hoge calciumconcentratie of met serum als methoden om differentiatie2,3,23te induceren . Een eerder rapport zorgvuldig vergeleken deze drie versc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door De Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010, H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); Radboud Universiteit fellowship (H.Z.); en Chinese Scholarship Council grant 201406330059 (J.Q.).
Materials
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | G2929BA | |
| Bovine pituitary extract (BPE) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| CFX96 Real-Time system | Bio-Rad | qPCR machine | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Ethanolamine >= 98% | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| High Sensitivity DNA chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Hydrocortison | Lonza | Part of the bulletKit | |
| Insulin | Lonza | Part of the bulletKit | |
| iQ SYBR Green Kit | BioRad | 170-8886 | |
| iScript cDNA synthesis | Bio rad | 1708890 | |
| KAPA Library Quant Kit | Roche | 07960255001 | Low concentration measure kit |
| KAPA RNA HyperPrep Kit with RiboErase | Roche | KK8540 | RNAseq kit |
| KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit | Lonza | 192060 | |
| Nanodrop | deNovix | DS-11 FX (model) | Nanodrop and Qbit for DNA and RNA measurements |
| NEXTflex DNA barcodes -24 | Illumnia | NOVA-514103 | 6 bp long primers |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 |
Riferimenti
- Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
- Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation of in vitro keratinocytes requires multifactorial external control. PLoS One. 8 (10), 77507 (2013).
- Van Ruissen, F., et al. Induction of normal and psoriatic phenotypes in submerged keratinocyte cultures. Journal of Cellular Physiology. 168 (2), 442-452 (1996).
- Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
- Ali, N., et al. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
- Luis, N. M., et al. Regulation of human epidermal stem cell proliferation and senescence requires polycomb- dependent and -independent functions of Cbx4. Cell Stem Cell. 9 (3), 233-246 (2011).
- Mulder, K. W., et al. Diverse epigenetic strategies interact to control epidermal differentiation. Nature Cell Biology. 14 (7), 753-763 (2012).
- Poumay, Y., Pittelkow, M. R. Cell density and culture factors regulate keratinocyte commitment to differentiation and expression of suprabasal K1/K10 keratins. Journal of Investigative Dermatology. 104 (2), 271-276 (1995).
- Kouwenhoven, E. N., et al. Transcription factor p63 bookmarks and regulates dynamic enhancers during epidermal differentiation. EMBO Rep. 16 (7), 863-878 (2015).
- Qu, J., et al. Mutant p63 Affects Epidermal Cell Identity through Rewiring the Enhancer Landscape. Cell Reports. 25 (12), 3490-3503 (2018).
- Brunner, H. G., Hamel, B. C., Van Bokhoven, H. The p63 gene in EEC and other syndromes. Journal of Medical Genetics. 39 (6), 377-381 (2002).
- Browne, G., et al. Differential altered stability and transcriptional activity of DeltaNp63 mutants in distinct ectodermal dysplasias. Journal of Cell Science. 124, 2200-2207 (2011).
- . KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKit Available from: https://bioscience.lonza.com/Lonza_bs/CH/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000192060/KGM-Gold-Keratinocyte-Growth-Medium-BulletKit (2019)
- Doyle, K. a. M. . Protocols and applications guide. , (1996).
- . Hyperprep Kit Available from: https://sequencing.roche.com/en-us/products-solutions/by-category/Library-preparation/rna-library-preparation/kapa-rna-hyperprep-kit-with-riboerasehmr.html (2019)
- . TrimGalore Available from: https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore (2019)
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- . Convert chromosome names in a bigWig file Available from: https://gist.github.com/dpryan79/39c70b4429dd4559d88fb079b8669721 (2019)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48 (2009).
- Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
- Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
- Mullegama, S. V., et al. Nucleic Acid Extraction from Human Biological Samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
- Ma, F., et al. A comparison between whole transcript and 3′ RNA sequencing methods using Kapa and Lexogen library preparation methods. BMC Genomics. 20 (1), 9 (2019).
- Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
- Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction. Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21 (2014).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Medicine. 9 (1), 75 (2017).
- Oyola, S. O., et al. Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes. BMC Genomics. 13, 1 (2012).
- Quail, M. A., et al. Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries. Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13, 341 (2012).
- Ross, M. G., et al. Characterizing and measuring bias in sequence data. Genome Biology. 14 (5), 51 (2013).
- . ARMOR Available from: https://github.com/csoneson/ARMOR (2019)
- . snakemake-workflows Available from: https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows (2019)
