Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

O advento dos hiPSCs e o subsequente desenvolvimento de protocolos para sua diferenciação direcionada em diferentes tipos celulares permitiram estudar o desenvolvimento e a doença em nível molecular e específico do paciente, especificamente utilizando cardiomiócitos iPSC derivados do paciente (iPSC-CMs) para modelar cardiomiopatias^1,2. No entanto, uma grande limitação ao estudo do desenvolvimento e fisiologia utilizando o sistema iPSC e outros modelos in vitro é a ausência de um microambiente estruturado. In situ, as células são submetidas às restrições da matriz extracelular (ECM), bem como das células vizinhas. A composição bioquímica particular e a rigidez desses microambientes ditam a distribuição espacial das células, bem como os fatores disponíveis para o engajamento na adesão celular. Isso, por sua vez, influencia caminhos de sinalização intracelular, expressão genética e determinação do destino celular. Por exemplo, o iPSC-CM micropadronizado em forma de haste adulta tem uma capacidade de contração significativamente melhor, fluxo de cálcio, organização mitocondrial, eletrofisiologia e formação transversal-túbula³. Assim, as propriedades do microambiente são integrais na regulação das funções celulares.

As técnicas anteriores de micropadronização se baseavam fortemente na fotolitografia (Figura 1A). Nesta técnica, uma camada de polímero fotossensível, ou fotoresist, é girada sobre um substrato plano da solução para formar uma película fina de cerca de 1 μm de espessura. Em seguida, a luz ultravioleta (UV) é aplicada na fotoresiste através de uma máscara contendo o padrão desejado. A exposição à luz ultravioleta (UV) altera quimicamente a fotoresiste modificando sua solubilidade em sua respectiva solução de desenvolvedor, transferindo o padrão desejado da máscara para o substrato. Muitos métodos de micropadronização incorporam a fotolitografia, pois confere nanômetro ao controle de nível de micrômetro sobre o design dos padrões celulares. No entanto, o giro da fotoresistência é altamente sensível às impurezas, porque as menores partículas de poeira interromperão a propagação da solução em um filme fino. A fotolitografia deve, portanto, ser realizada em instalações não contaminadas, que são caras para manter e requerem especial perícia para utilizar. Além disso, os produtos químicos usados na fotolitografia são muitas vezes tóxicos para as células e podem desnaturar biomoléculas importantes. Assim, a fotolitografia coloca obstáculos significativos à fabricação de micropadrões para aplicações biológicas convenientes.

Em 1994, Whitesides e colegas⁴ superaram alguns dos desafios associados à fotolitografia ao pioneirismo de uma coleção de técnicas chamada litografia suave. Na litografia macia, uma superfície microestruturada feita com polidimetilsiloxano (PDMS), um material transparente, semelhante à borracha, é usada para gerar um padrão de proteínas ECM⁴. Técnicas litográficas macias comuns incluem impressão de microcontato e padronização microfluida. Na impressão por microcontato, atualmente o método litográfico macio mais popular, um selo PDMS revestido com proteínas ECM transfere o material para uma superfície nas áreas contatadas pelo selo(Figura 1B). Na padronização microfluida, as microestruturas são projetadas em uma superfície PDMS de tal forma que quando o selo é pressionado para um substrato, uma rede de microcanais, através da qual os fluidos podem ser entregues às áreas desejadas, é criada (Figura 1C)⁵. A litografia suave oferece vários benefícios sobre a fotolitografia. Uma vez que um wafer mestre é microfabricado, os selos PDMS podem ser facilmente replicados sem maior emprego de instalações de quarto limpo. Além disso, a ausência de solventes orgânicos no processo de litografia macia permite a utilização de materiais poliméricos como o poliestireno, normalmente utilizado na cultura celular. Finalmente, a micropadronização usando métodos litográficos macios não se restringe a superfícies planas. Assim, a litografia suave aumenta a acessibilidade e funcionalidade da fabricação de micropadrões sobre a fotolitografia⁶. No entanto, a litografia suave tem desvantagens significativas. Por exemplo, um passo inicial de gravação, usando fotolitografia, ainda é necessário para microfabricar o selo. Além disso, a micropadronização utilizando um selo PDMS está sujeita a variações na qualidade da transferência de proteínas para o substrato⁶. Evitar essas discrepâncias requer otimização e consistência na pressão aplicada ao selo PDMS durante a transferência de proteínas, caso contrário, a deformação e distorção dos tamanhos de recurso dos moldes PDMS podem ocorrer⁶. Há também uma grande preocupação em usar repetidamente o PDMS devido à absorção de pequenas moléculas⁷.

Para evitar o uso de selos de fotolitografia macia e PDMS, descrevemos um método de micropadronização de células únicas sem litografia, baseado em estêncil, livre de litografia, que supera muitos dos obstáculos associados à fotolitografia e à litografia suave. Neste método, um hidrogel de poliacrilamida é usado como substrato para incorporação de proteína stencil à base de ECM, permitindo o revestimento seletivo de hº-CMs únicos. Esta técnica é altamente compatível com materiais poliméricos usados em condições clássicas de cultura celular. Além disso, com a limpeza e manutenção adequadas, os estêncil são reutilizáveis e resistentes à degradação e absorção de proteínas durante o processo de microfabricação. Finalmente, o processo de padronização é tecnicamente robusto, barato, personalizável e acessível àqueles sem habilidades especializadas em bioengenharia. Esta técnica de micropadronização baseada em estêncil tem sido amplamente utilizada em nossas publicações recentes modelando cardiomiopatias variadas^8,9,10.