레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝
Summary
이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.
Abstract
마이크로 패터닝 기술은 세포 생물학에서 세포 모양과 크기를 단일 세포 해상도에서 세포 운명 결정에 미치는 영향을 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 현재 최첨단 단일 셀 마이크로 패터닝 기술은 강력한 기술이지만 숙련 된 엔지니어링 기술과 미세 제작에 대한 특정 시설 지원이 필요한 소프트 리소그래피 및 마이크로 접촉 인쇄를 포함합니다. 이러한 제한은 보다 접근하기 쉬운 기술이 필요합니다. 여기에서는 스텐실 기반 단일 셀 패터닝이라는 간단한 대체 리소그래피 없는 방법을 설명합니다. 우리는 스텐실 설계, 폴리아크릴아미드 하이드로겔 제조, 스텐실 기반 단백질 통합, 세포 도금 및 배양을 포함한 단계별 절차를 제공합니다. 이 간단한 방법은 최대 2,000개의 셀 배열을 패턴화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 1:1 정사각형에서 7:1 성인 심근세포와 같은 직사각형까지, 뚜렷한 세포 모양을 가진 단일 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 파생된 심근세포의 패터닝을 보여줍니다. 이 스텐실 기반 단일 세포 패터닝은 리소그래피가 없고 기술적으로 견고하며 편리하며 저렴하며 생물 공학적 배경이 제한된 사람들에게 가장 중요한 접근성을 갖추고 있습니다.
Introduction
hiPSCs의 출현 및 상이한 세포 유형으로의 그들의 지시된 분화에 대한 프로토콜의 후속 개발은 특히 환자 유래 iPSC 심근세포(iPSC-CMs)를 사용하여 심근병증1,,2를모델링하기 위해 분자 및 환자 별 수준에서 개발 및 질병을 연구할 수 있게 하였다. 그러나, iPSC 시스템 및 기타 시험관내 모델을 이용한 개발 및 생리학을 연구하는 데 큰 한계는 구조화 된 미세 환경의 부재이다. 이 환경에서 세포는 세포외 매트릭스(ECM)뿐만 아니라 인접 세포의 제약을 받습니다. 이러한 미세 환경의 특정 생화학 적 조성 및 강성은 세포의 공간 분포뿐만 아니라 세포 접착에 관여하는 데 사용할 수있는 요인을 지시합니다. 이것은, 차례차례로, 세포내 신호 통로, 유전자 발현 및 세포 운명 결정에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 성인형 로드 형상의 마이크로패턴 iPSC-CM은 현저히 더 나은 수축능력, 칼슘 흐름, 미토콘드리아 조직, 전기생리학, 및 횡-환관 형성3을가지는 것이다. 따라서, 미세 환경의 특성은 세포 기능의 조절에 필수적이다.
이전의 마이크로 패터닝 기법은 포토리소그래피에 크게 의존했습니다(그림1A). 이 기술에서 감광성 폴리머 또는 포토레지스트층은 용액으로부터 평평한 기판상에 스펀되어 약 1 μm 두께의 박막을 형성한다. 다음으로, 자외선(UV) 광은 원하는 패턴을 함유하는 마스크를 통해 포토레지스트에 적용된다. 자외선(UV) 빛에 노출되면 해당 개발자 용액에서 용해도를 수정하여 원하는 패턴을 마스크에서 기판으로 전달하여 포토레지스트를 화학적으로 변화시다. 많은 마이크로 패터닝 방법은 나노미터를 마이크로미터 수준의 제어에 부여하여 세포 패턴의 설계를 제어하기 때문에 포토리소그래피를 통합합니다. 그러나, 포토레지스트의 방적은 불순물에 매우 민감하며, 이는 가장 작은 먼지 입자가 용액을 박막으로 확산하는 것을 방해하기 때문이다. 따라서 포토리소그래피는 오염되지 않은 시설에서 수행되어야 하며, 유지 보수비용이 많이 들고 활용하기 위해서는 특별한 전문 지식이 필요합니다. 또한, 포토리소그래피에 사용되는 화학 물질은 종종 세포에 독성이 있으며 중요한 생체 분자를 변성시킬 수 있습니다. 따라서, 포토리소그래피는 편리한 생물학적 응용을 위한 마이크로패턴의 제조에 중대한 장애물을 제기한다.
1994년 Whitesides와 동료4는 소프트 리소그래피라는 기술 컬렉션을 개척하여 포토리소그래피와 관련된 몇 가지 과제를 극복했습니다. 연질 리소그래피에서 투명한 고무와 같은 재료인 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 만든 미세 구조화된 표면이 ECM 단백질4의패턴을 생성하는 데 사용됩니다. 일반적인 연질 리소그래피 기법에는 마이크로접촉 인쇄 및 미세 유체 패터닝이 포함됩니다. 마이크로 접촉 인쇄, 현재 가장 인기있는 연질 석판화 방법, ECM 단백질로 코팅 PDMS 스탬프는 스탬프에 의해 접촉 된 영역에서 표면에 물질을 전송(그림 1B). 미세 유체 패터닝에서 미세 구조는 스탬프가 기판에 가압될 때, 유체가 원하는 영역으로 전달될 수 있는 마이크로채널 네트워크가 생성되도록 PDMS 표면에 설계된다(도1C)5. 소프트 리소그래피는 포토리소그래피보다 몇 가지 이점을 제공합니다. 마스터 웨이퍼를 마이크로 제작하면, PDMS 스탬프는 클린룸 시설을 더 이상 고용하지 않고도 쉽게 복제할 수 있습니다. 또한, 연질 리소그래피 과정에서 유기 용매의 부재는 일반적으로 세포 배양에 사용되는 폴리스티렌과 같은 고분자 물질의 활용을 허용한다. 마지막으로, 부드러운 석판화 방법을 사용한 미세 패턴화는 평평한 표면에 국한되지 않습니다. 따라서, 부드러운 리소그래피는 포토리소그래피6을통해 마이크로패턴 제작의 접근성과 기능을 증가시킨다. 그러나 소프트 리소그래피에는 상당한 단점이 있습니다. 예를 들어, 포토리소그래피를 사용하는 초기 에칭 단계는 여전히 스탬프를 미세 제작하는 데 필요합니다. 또한, PDMS 스탬프를 이용한 마이크로패터닝은 기판 상에 단백질 전달의 품질에 변화가있다(6). 이러한 불일치를 방지하려면 단백질 전달 동안 PDMS 스탬프에 가해지는 압력의 최적화 및 일관성이 필요하며, 그렇지 않으면 PDMS 금형의 특징 크기의 변형 및 왜곡이 발생할 수 있다6. 또한 소분자 흡수로 인한 PDMS를 반복적으로 사용하는 주요 관심사도7.
소프트 포토리소그래피와 PDMS 스탬프를 사용하지 않으려면, 포토리소그래피 및 연리소그래피와 관련된 많은 장애물을 극복하는 스텐실 기반의 리소그래피 없는 단일 세포 마이크로패터닝 방법을 설명합니다. 이 방법에서 폴리아크릴아미드 하이드로겔은 스텐실 계 ECM 단백질 혼입을 위한 기판으로 사용되어 단일 hiPSC-CM의 선택적 도금을 허용한다. 이 기술은 고전적인 세포 배양 조건에서 사용되는 폴리머 재료와 매우 호환됩니다. 또한 적절한 세척 및 유지 보수를 통해 스텐실은 재사용이 가능하며 미세 제조 공정 중 열화 및 단백질 흡수에 강합니다. 마지막으로, 패터닝 프로세스는 기술적으로 견고하고 저렴하며 사용자 정의 가 가능하며 전문 적인 생명 공학 기술이없는 사람들에게 접근 할 수 있습니다. 이러한 스텐실 기반 마이크로패터닝 기법은 최근 간행물에서 다양한 심근병증8,,9,,10을모델링하는 데 광범위하게 활용되고 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 부착 세포의 효과적인 패터닝을 가능하게 하는 리소그래피 없는 스텐실 기반 마이크로패터닝 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는 생리학적 또는 병리학적으로 관련된 조직 강성 또는 실리콘 기반 탄성중합체 기질을 가진 폴리아크릴아미드 하이드로겔의 미세 패턴화 지하 막 매트릭스 단백질 섬에 의해 서로 다른 길이 대 폭 비율로 hiPSC-CM의 패터닝을 시연합니다. 이 방법은 포토리소?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 스탠포드 아동 건강 연구소 (CHRI)와 건강의 국립 연구소 (1F32HL142205-01)에서 S.L에 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었다, NIH 이사의 개척자 상 (LM012179-03), 미국 심장 협회 설립 조사자 상 (17EIA33410923), 스탠포드 심장 혈관 연구소, 호프만과 슈로퍼 재단, 그리고 심장 혈관 의학의 스탠포드 부서, S.M.W에 의학부 , 국립 보건원 (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL113968) 및 담배 관련 질병 연구 프로그램 (TRDRP 27IR-0012) J.C.W, 미국 심장 협회 (AHA) 박사 후 펠로우십 상 (18POST34030106) H.Y. 우리는 마이크로 패턴 hiPSC-CM의 공초점 화상 진찰의 지원에 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스에서 박사 앤드류 올슨 에게 감사드립니다. 우리는 폴리 아크릴아미드 하이드로 겔 코팅 커버 슬립에 iPSC-CM의 첫 번째 스텐실 디자인, 제조, 단일 세포 마이크로 패터닝, 단일 세포 마이크로 패턴 iPSC-CM의 sarcomere 구조의 예비 공초점 이미징에 대한 H.Y.에 감사드립니다.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Riferimenti
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