レーザーカットステンシルを用いたシンプルリソグラフィフリーシングルセルマイクロパターニング
Summary
このプロトコルは、限られたバイオエンジニアリングのバックグラウンドを持つ人が簡単でアクセスできるリソグラフィーフリーのマイクロパターン化方法を導入しています。この方法は、カスタマイズされたレーザーカットステンシルを利用して、細胞形態を調節するために目的の形をした細胞外マトリックスタンパク質をマイクロパターン化します。マイクロパターン化の手順は、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を用いて実証される。
Abstract
マイクロパターニング技術は、細胞の形状とサイズを制御する単一細胞の分解能における細胞の運命決定の影響を研究するために、細胞生物学で広く使用されてきました。現在の最先端の単一セル顕微鏡技術には、ソフトリソグラフィとマイクロコンタクト印刷が含まれますが、これは強力な技術ですが、訓練を受けたエンジニアリングスキルとマイクロファブリケーションにおける特定の施設サポートが必要です。これらの制限には、よりアクセスしやすい手法が必要です。ここでは、単純な代替リソグラフィフリー方式であるステンシルベースの単一セルパターンについて説明します。ステンシルデザイン、ポリアクリルアミドヒドロゲル製造、ステンシルベースのタンパク質取り込み、細胞めっき培養など、ステップバイステップの手順を提供しています。この単純な方法を使用して、2,000 個ものセルの配列をパターン化できます。我々は、1:1の正方形から7:1の成体心筋細胞様長方形に、明確な細胞形状を有する単一のヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)に由来する心筋細胞のパターン化を実証する。このステンシルベースの単一セルパターニングは、リソグラフィーフリー、技術的に堅牢で便利で、安価で、最も重要なのは限られたバイオエンジニアリングの背景を持つものにアクセス可能です。
Introduction
hiPSCの出現とその後の異なる細胞型への指向分化のためのプロトコルの開発により、特に患者由来のiPSC心筋細胞(iPSC-CM)を用いて心筋症を,モデル化する分子および患者固有のレベルでの発達と疾患の研究が可能になった。しかし、iPSCシステムや他のin vitroモデルを用いた開発・生理学の研究には、構造化された微小環境がないことが大きな制限です。細胞は、細胞外マトリックス(ECM)の制約に加え、また隣接する細胞にも供される。これらの微小環境の特定の生化学的組成と剛性は、細胞の空間分布だけでなく、細胞接着に従事するために利用可能な要因を決定します。これは、今度は、細胞内シグナル伝達経路、遺伝子発現、および細胞運命決定に影響を及ぼす。例えば、成体状棒状のマイクロパターン化されたiPSC-CMは、著しく優れた収縮能力を有し、カルシウム流、ミトコンドリア組織、電気生理学、および横管状形成3。したがって、微小環境の特性は、細胞機能の調節に不可欠である。
以前のマイクロパターニング技術はフォトリソグラフィに大きく依存していました(図1A)。この技術では、感光性ポリマー、またはフォトレジストの層を、溶液から平坦な基板上で紡がれ、厚さ約1μmの薄膜を形成する。次に、紫外(UV)光を、所望のパターンを含むマスクを通してフォトレジストに照射する。紫外線(UV)光への曝露は、それぞれの現像液におけるその溶解性を改変することによりフォトレジストを化学的に変え、マスクから基板上に所望のパターンを移す。多くのマイクロパターニング法は、ナノメートルからマイクロメートルレベルの細胞パターンの設計制御を与えるフォトリソグラフィを組み込んでいます。しかし、フォトレジストの紡糸は、最小の塵粒子が薄膜への溶液の拡散を妨げるため、不純物に対して非常に敏感である。したがって、フォトリソグラフィは、維持にコストがかかり、利用するために特別な専門知識を必要とする、汚染されていない施設で行う必要があります。また、フォトリソグラフィーに用いられる化学物質は、しばしば細胞に対して毒性があり、重要な生体分子を変性させる可能性があります。したがって、フォトリソグラフィは、便利な生物学的用途のためのマイクロパターンの作製に重大な障害をもたらす。
1994年、Whitesidesたちの4社は、ソフトリソグラフィと呼ばれる技術のコレクションを開拓することで、フォトリソグラフィに関連する課題のいくつかを克服しました。ソフトリソグラフィでは、ポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られた微小構造表面を、透明でゴム状の材料で、ECMタンパク質4のパターンを生成するために使用される。一般的なソフトリソグラフィ技術には、マイクロコンタクト印刷とマイクロ流体パターンが含まれます。マイクロコンタクト印刷では、現在最も一般的なソフトリソグラフィ法で、ECMタンパク質で被覆されたPDMSスタンプは、スタンプが接触する領域で表面に材料を移動する(図1B)。マイクロ流体パターン化では、マイクロストラクチャは、スタンプが基板に押し込まれると、流体を所望の領域に送達できるマイクロチャネルのネットワークが作成されるようにPDMS表面上に設計される(図1C)5。5柔らかいリソグラフィはフォトリソグラフィよりいくつかの利点を提供する。マスターウエハがマイクロハブ化されると、PDMSスタンプは、クリーンルーム設備のさらなる雇用なしに簡単に複製することができます。さらに、ソフトリソグラフィーの過程で有機溶媒が存在しない場合、ポリスチレンなどの高分子材料の利用が可能であり、細胞培養において典型的に使用される。最後に、ソフトリソグラフィ法によるマイクロパターニングは、平坦な面に限定されません。したがって、ソフトリソグラフィはフォトリソグラフィ6に対するマイクロパターン製作のアクセシビリティと機能性を高める。しかし、ソフトリソグラフィには大きな欠点があります。例えば、初期エッチング工程は、フォトリソグラフィを用いて、スタンプを微細加工するために依然として必要とされる。また、PDMSスタンプを用いたマイクロパターニングは、基板6へのタンパク質転写の質のばらつきの影響を受ける。これらの不一致を回避するには、タンパク質の移動中にPDMSスタンプに加えられる圧力の最適化と一貫性が必要であり、そうでなければPDMS金型の特徴サイズの変形および歪みが6で起こり得る。また、小分子吸収によるPDMSの繰り返し使用の大きな懸念も7.
柔らかいフォトリソグラフィやPDMSスタンプの使用を避けるために、フォトリソグラフィとソフトリソグラフィに関連する多くの障害を克服するステンシルベースのリソグラフィフリー単一細胞顕微鏡法について説明します。この方法では、ポリアクリルアミドヒドロゲルをステンシルベースECMタンパク質取り込みの基質として用い、単一hiPSC-CMの選択メッキを可能にする。この技術は、古典的な細胞培養条件で使用されるポリマー材料との互換性が高い。さらに、適切な洗浄とメンテナンスにより、ステンシルは再利用可能であり、微細加工プロセス中の分解およびタンパク質吸収に耐性があります。最後に、パターニングプロセスは技術的に堅牢で、安価でカスタマイズ可能で、専門的なバイオエンジニアリングスキルを持たない人がアクセスできます。このステンシルベースのマイクロパターニング技術は、最近の出版物で、多様な心筋症88、9、109,10をモデル化する際に広く利用されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
接着細胞の効果的なパターニングを可能にするリソグラフィーフリーステンシルベースのマイクロパターニング法について述べた。このプロトコルでは、生理学的または病理学的に関連する組織の剛性またはシリコンベースのエラストマー基質を有するポリアクリルアミドヒドロゲル上の基質膜マトリックスタンパク質島をマイクロパターン化することにより、異なる長さと幅比でhiPSC-CMの?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スタンフォード小児保健研究所(CHRI)と国立衛生研究所(1F32HL142205-01)からS.L.への博士研究員によって支えられ、 NIHディレクターズパイオニア賞(LM012179-03)、米国心臓協会設立調査官賞(17EIA33410923)、スタンフォード心臓血管研究所、ホフマンとシュローファー財団、スタンフォード心臓血管医学部門、医学部S.M.W.に、国立衛生研究所(UG3 TR002588、P01 HL141084、および R01 HL126527、R01 HL113006、R01 HL123968)およびタバコ関連疾患研究プログラム(TRDRP 27IR-0012)からJ.C.W.、米国心臓協会(AHA)ポストドクラルフェローシップ賞(18POST34030106)からH.Y.、およびヘンバーガー・スト長へスタンフォード神経科学顕微鏡サービスのアンドリュー・オルセン博士に、マイクロパターン化hiPSC-CMの共焦点イメージングのサポートに感謝します。H.Y.は、ポリアクリルアミドヒドロゲル被覆滑膜上のiPSC-CMの最初のステンシル設計、製造、単一細胞マイクロパターニング、および単細胞微小パターン化iPSC-CMのサルコメア構造の予備的共焦点イメージングに感謝します。
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
Riferimenti
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
