Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie
Summary
Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung biologischer Kryoproben für Synchrotron-basierte Röntgenabsorptionsspektroskopie-Experimente vor. Wir beschreiben alle Schritte, die zur Optimierung der Probenvorbereitung und Kryokonservierung erforderlich sind, anhand von Beispielen für das Protokoll mit Krebs- und Phytoplanktonzellen. Diese Methode bietet einen universellen Standard für die Kryopräparation von Proben.
Abstract
Die Untersuchung von Elementen mit Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) ist von besonderem Interesse, wenn es darum geht, die Rolle von Metallen in biologischen Systemen zu untersuchen. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiges und oft komplexes Verfahren, insbesondere für biologische Proben. Obwohl Röntgenspeziationstechniken weit verbreitet sind, wurde noch kein detailliertes Protokoll für Benutzer der Technik verbreitet. Darüber hinaus ist die Modifikation des chemischen Zustands besorgniserregend, und kryobasierte Techniken werden empfohlen, um die biologischen Proben in ihrem fast nativen hydratisierten Zustand zu analysieren, um die maximale Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen oder Gewebe zu gewährleisten. Hier schlagen wir ein zelluläres Präparationsprotokoll vor, das auf kryokonservierten Proben basiert. Es wird in einer hochauflösenden fluoreszenzdetektierten Röntgenabsorptionsspektroskopie von Selen in Krebszellen und einer Studie von Eisen in Phytoplankton demonstriert. Dieses Protokoll kann mit anderen biologischen Proben und anderen Röntgentechniken verwendet werden, die durch Bestrahlung beschädigt werden können.
Introduction
Die Untersuchung der zellulären Biotransformationen essentieller oder toxischer Elemente erfordert Speziationstechniken mit hoher Empfindlichkeit und sollte die Probenvorbereitungsschritte minimieren, die häufig zur Modifikation chemischer Spezies neigen.
Es ist bekannt, dass physiologische Elemente wie Selen und Eisen aufgrund ihrer komplexen Chemie, der verschiedenen Eigenschaften der Selen- oder Eisenspezies und ihrer geringen Konzentration im ppm- (mg/kg) oder sogar sub-ppm-Bereich besonders schwer zu speziieren sind. Daher kann das Studium der Speziation dieser Elemente durch XAS äußerst schwierig sein. Synchrotron XAS und insbesondere hochauflösende fluoreszenzdetektierte XAS (HERFD-XAS), die ein sehr niedriges Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis1 ermöglichen, stehen an Synchrotronquellen zur Verfügung, um hochverdünnte Elemente in komplexen biologischen Matrizen zu spezitieren 2,3. Herkömmliche Fluoreszenz-XAS-Messungen können mit einem energieaufgelösten Festkörperdetektor (SSD) mit einer Energiebandbreite von ~150–250 eV auf der CRG-FAME-Beamline an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4 durchgeführt werden, während HERFD-XAS-Messungen ein Kristallanalysatorspektrometer (CAS) mit einer Energiebandbreite von ~1–3 eV auf der CRG-FAME-UHD-Beamline am ESRF2 benötigen. . Fluoreszenzphotonen werden hinsichtlich ihrer Energie bei elektronischen bzw. optischen Verfahren diskriminiert.
Die Kryopräparation der Probe ist unerlässlich, um Strukturen zu erhalten und die chemische Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten, wodurch eine Analyse nahe am biologischen nativen Zustandermöglicht wird 5. Darüber hinaus ermöglichen Analysen, die bei kryogenen Temperaturen von bis zu 10 K mit flüssiger heliumkryogener Kühlung (LN2) durchgeführt werden, eine Verlangsamung der Strahlenschäden und die Erhaltung der Elementartbildung für XAS. Obwohl einige Übersichtsarbeiten zu XAS-Techniken, die auf biologische Proben angewendet werden, die Notwendigkeit der Vorbereitung und Analyse von Proben unter kryogenen Bedingungen berichten (z. B. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschreibt keiner von ihnen eindeutig das zugehörige detaillierte Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird ein Verfahren zur Kryopräparation von Krebszellen und Planktonmikroorganismen für die HERFD-XAS-Speziation von Se8 und Fe9 bei kryogener Temperatur beschrieben.
Gute Praktiken für die Probenvorbereitung und -umgebung bei hochmodernen XAS-Spektroskopiemessungen erfordern 1) eine Einrichtung; 2) ein Analyseverfahren, das die Auswirkungen von Strahlenschäden so weit wie möglich begrenzt; und 3) eine Probe (oder Modellverbindungsreferenz), die in Bezug auf die Strahlgröße der Röntgenphotonen so homogen wie möglich ist. Der erste Punkt wird berücksichtigt, indem die Erfassung bei niedriger Temperatur unter Verwendung eines flüssigen Heliumkryostaten durchgeführt wird. Der zweite Punkt wird behandelt, indem jede Akquisition auf einem frischen Bereich der Probe durchgeführt wird, indem sie in Bezug auf den Balken bewegt wird. Unter Berücksichtigung der dritten Bedingung werden schließlich Proben (Pellets) und Referenzen (Pulver) in gepressten Bulk-Pellets konditioniert, um Porositäten und Inhomogenitäten so weit wie möglich zu begrenzen und Rauheiten in Bezug auf die Strahlgröße auf der röntgensondierten Probenoberfläche zu vermeiden. Wir erklären, wie das Protokoll mit all diesen Punkten umgeht.
Wir verwendeten die humane Prostatazelllinie PC-3 (hohes metastasierendes Potenzial) und die Eierstockzelllinie OVCAR-3 (die bis zu 70% aller Eierstockkrebsfälle ausmacht), um die antiproliferativen Eigenschaften von Krebszellen von Selennanopartikeln (Se-NPs) und Phaeodactylum tricornutum diatomee als Modellspezies zur Untersuchung der Eisensequestrierung in Phytoplankton zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die chemische Form von Selen und Eisen in biologischen Proben durch Röntgenabsorptionsspektroskopie zu untersuchen. Es konzentriert sich auf die Kryopräparation und Lagerung von biologischen Proben und Referenzverbindungen sowie auf die HERFD-XAS-Messungen.
Kryo-Aufbereitung und Lagerung
Die Kryo-Aufbereitung der biologischen Probenpellets ermöglicht die Erhaltung der chemischen Integrität der in den Proben vorhandenen Spezies. Dies …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken CEMHTI (Orleans, Frankreich, ANR-13-BS08-0012-01) und Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankreich, ANR-10-LABX-0056) für die Beamline-Entwicklung. Das FAME-UHD-Projekt wird vom französischen “grand emprunt” EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), dem CEA-CNRS CRG-Konsortium und dem INSU CNRS-Institut finanziell unterstützt. Wir sind dankbar für alle Beiträge während der Experimente, insbesondere für alle Personen, die an BM30B und BM16 arbeiten. Die Autoren würdigen die European Synchrotron Radiation Facility für die Bereitstellung der Synchrotronstrahlungsstrahlzeit. Wir erkennen auch das PHYTOMET ANR-Projekt für finanzielle Unterstützung (ANR-16-CE01-0008) und das SEDMAC-Projekt für finanzielle Unterstützung (INCA-Plan cancer-ASC16019CS) an.
Materials
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
Riferimenti
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