Markerless Gene Deletion von Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis ist die Hauptursache für bakterielle sexuell übertragbare Krankheiten und stellt eine erhebliche Belastung für die menschliche Gesundheit dar. Über 100 Millionen Menschen sind jedes Jahr mit C. trachomatis¹infiziert. Ungefähr 70% der Infektionen bei Frauen sind asymptomatisch, trotz schädlicher reproduktiver Gesundheitlichen Auswirkungen, wie beckenentzündliche Erkrankungen, ektopische Schwangerschaft, und/oder Unfruchtbarkeit. Krankheitsfortsetzungen stehen in direktem Zusammenhang mit der Immunpathologie, die durch die Infektion mit C. trachomatis initiiert wurde². Ein wirksamer Impfstoff muss noch entwickelt werden; Daher ist das Verständnis der Funktion von bakteriellen Virulenzfaktoren und anderen bakteriellen Genprodukten eine wichtige und dringende Forschungsfrage.

Als intrazelluläre Bakterien, Wirtszellinvasion, intrazelluläre Replikation, Freisetzung von Nachkommen, und Ausweichen von Host immunologischen Reaktionen sind kritische Prozesse. C. trachomatis bildet ein parasitophores membrangebundenes Vakuol, das als Inklusion bezeichnet wird, für die intrazelluläre Entwicklung. Die Etablierung der Inklusion und viele andere kritische Prozesse werden durch Sekretion von Effektorproteinen über ein Typ-III-Sekretionssystem (T3SS)³erreicht. Die Aufklärung der Funktionen dieser sezernierten Effektoren war für viele Jahre aufgrund der genetischen Unnachgiebigkeit von C. trachomatisbegrenzt. Im Gegensatz zu E. colisind viele klassische Klontechniken nicht auf Chlamydienanwendbar. Einige wichtige Einschränkungen sind Transformationseffizienz, mangels Gegenauswahl-Reporter wie sacB und Plasmid-Wartung. Während E. coli-Plasmide in der Regel auf unbestimmte Zeit mit einem Ursprung der Replikation und einem angemessenen selektiven Druck aufrechterhalten werden können, benötigt C. trachomatis plasmide weitere acht offene Leserahmen(pgp1-8) für die Wartung, die auf dem nativen pL2-Plasmid innerhalb des L2-Serovar⁴gefunden werden.

In den letzten Jahren wurden mehrere genetische Werkzeuge generiert, die Chlamydias einzigartige Biologie aufnehmen, aber es gibt immer noch Einschränkungen^5,6,7. Chemische Mutagenese durch Ethylmethansulfonat (EMS) Behandlung kann Fehlsinne Mutationen führen, oder (weniger häufig) kann in Nukleotid-Übergänge führen Einführung eines vorzeitigen Stop-Codon, um eine Unsinn-Mutation zu ergeben⁸. Transposon-Einfügung ist effizient für Genstörungen, aber die aktuelle Technologie in der Chlamydien-Forschung ist mühsam und zeitaufwändig⁹. Sowohl EMS-Behandlung als auch Transposon-Mutagenese-Techniken erzeugen zufällige Mutationen und erfordern strenge Screening-Methoden, um mutierte Stämme zu isolieren. Eine Methode zur Störung von Genen durch Einsetzen von Introns der Gruppe II (z. B. TargeTron) ermöglicht eine gerichtete Mutagenese; Diese Methode ist jedoch durch die Effizienz eingeschränkt, und die Einfügestelle wird nicht immer richtig vorhergesagt¹⁰.

Fluoreszenz-gemeldete allelische Austauschmutagenese (FRAEM) ist eine Strategie für die gezielte Genlöschung gekoppelt mit dem Einsetzen einer Selektionskassette mit Antibiotikaresistenz und einem Fluoreszenzreporter¹¹. FraEM wird jedoch durch das Potenzial von kassetteninduzierten Polareffekten auf nachgeschaltete Gene erschwert, insbesondere wenn es um Gene innerhalb polycistronischer Operonen geht. Floxed Kassette allelic Exchange Mutagenesis (FLAEM) ist ein neuartiger genetischer Ansatz entwickelt, um die Kassette-induzierten Polareffekte zuvor mit der FRAEM-Auswahlkassette¹²beobachtet zu lindern. FLAEM nutzt die Cre-loxP-Genombearbeitung, um die Selektionskassette zu entfernen und die Expression nachgeschalteter Gene wiederherzustellen. Die Selektionskassette mit Antibiotikaresistenz und grünem Fluoreszenzprotein (GFP) wird mit flankierenden LoxP-Standorten umgestaltet. Diese loxP-Sites können in Gegenwart von Cre Recombinase rekombinieren und zur Exzision der Kassette aus dem Genom¹³führen. Diese Strategie hat gezeigt, Kassette induzierte Polareffekte zu lindern, wenn tmeA zum Löschen^12,14.

Sowohl FRAEM- als auch FLAEM-Methoden verwenden denselben Selbstmordvektor, pSUmC 4.0, der durch induzierbare Expression von pgp6 bedingt aufrechterhalten werden kann. Die Expression von pgp6 hat sich bisher als notwendig für die Plasmidretention erwiesen und wird daher zur Kontrolle der Plasmidpflege^11,15genutzt. Wenn C. trachomatis in Medien angebaut wird, die mit wasserfreiem Tetracyclin (aTc) ergänzt werden, um pgp6 Expression zu induzieren, wird der Vektor beibehalten. In Ermangelung von aTc geht der Vektor verloren. Die gezielte Genlöschung wird durch den allelischen Austausch des Gens für die Selektionskassette erreicht. Die 3 kb Regionen direkt vor und flussabwärts des Zielgens dienen als Homologiearme zur Rekombination. Diese Arme werden in den pSUmC 4.0-Vektor geklont, der die Auswahlkassette flankiert. Erfolgreiche C. Trachomatis Transformation und Rekombination summieren sich an Fluoreszenzberichten. Der Ausdruck von mCherry auf dem Vektor-Backbone und gfp innerhalb der Selektionskassette ergeben rote und grüne fluoreszierende Einschlüsse. Sobald aTc aus Kulturmedien entfernt wurde, weisen nur grüne Einschlüsse auf erfolgreiche Rekombinationsereignisse mit dem Verlust des Selbstmordvektors und der Integration der Selektionskassette in das bakterielle Genom hin.

FLAEM stellt eine Erweiterung von FRAEM durch nachfolgende Transformation eines Cre Recombinase-expressing Vektors, pSU-Cre, in den neu geschaffenen mutierten Stamm dar. Die Cre-Rekombinantase erleichtert die Rekombination zwischen loxP-Standorten und die Exzision der Selektionskassette. Rekombinationsereignisse werden über die Fluoreszenzberichterstattung angezeigt. Der pSU-Cre-Vektor kodiert mCherry; Daher wird eine erfolgreiche Transformation durch Zugabe von roter Fluoreszenz zu gfp-exezierenden Einschlüssen angezeigt. Der Anbau ohne selektiven Druck für die Kassette führt zu einer cre-vermittelten Rekombination an den LoxP-Standorten, und der Verlust der Kassette wird durch reine Roteinschlüsse angezeigt. Wie bei pSUmC-4.0 wird die induzierbare Expression von pgp6 verwendet, um pSU-Cre bedingt aufrechtzuerhalten. Sobald aTc und Antibiotika-Auswahl entfernt sind, wird das Plasmid ausgehärtet, und der resultierende markerlose Deletionsstamm ist nicht fluoreszierend. Diese Methode befasst sich mit dem Problem der kassetteninduzierten Polareffekte.