인간 소변 유래 세포에서 얻은 직접 재프로그래밍 된 Myotube에서 건너 뛰는 Exon

신경과 정신의학의 국립 센터의 윤리위원회는이 연구를 승인 (승인 ID: A2017-018, A2018-029). 모든 개인은 소변을 제공하기 전에 정보에 입각한 동의를 했다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다. 1. UdC의 격리 및 기본 문화 참고: DDC는 이전에 게시된 프로토콜8,,9,,10에 따라 일부 수정으로 격리되었습니다. 멸균 된 플라스틱 병에 자발적인 유동 동안 소변 샘플을 수집합니다.참고 : 외부 요도 오리피스의 살균은 필요하지 않습니다. 미드스트림 소변은 바이러스 오염의 위험을 줄이는 것이 바람직하다. 다음 절차 전에 재고 시간이 >1 시간인 경우, 소변 샘플은 세포 생존력을 보존하기 위해 4 °C로 옮겨져야 한다. 그러나 불용성 침전제가 나타날 수 있으므로 <4 °C의 온도는 피해야 합니다. 실온에서 10 분 동안 400 x g에서 전체 소변 샘플을 원심 분리합니다. 상한을 흡인하여 튜브에 1 mL을 남깁니다. 소변의 나머지 1 mL에 개별적으로 펠릿을 다시 중단하고 단일 50 mL 튜브에 수집. 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 99 mL, 페니실린/스트렙토마이신(P/S), 0.5 μg/mL 암포테리신 B, 원심분리기로 구성된 10 mL의 세척 버퍼를 실온에서 10분 동안 200 x g으로 추가합니다. 상한을 흡인하여 튜브에 0.2 mL를 남깁니다. 고혈당 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)를 1:1 혼합물로 구성된 1.5 mL의 1차 배지에서 세포 펠릿을 재조합인간 표피 성장 인자(EGF), 인슐린, 하이드로 코르티손, 피네프린, T3, 트랜스 페이트랜스린, 10 % 테트라 사이클린이없는 태아 소 혈청 (FBS), 1 % P / S, 0.5 μg / mL 암포테리신 B. 젤라틴 코팅 된 6 개의 웰 플레이트의 3 개의 우물에서 세포를 시드합니다 (각 우물의 총 부피, 1.5 mL). 배양은 24시간 동안 37°C 및 5%CO2에서 가습하였다. 다음 3 일 동안 매일 기본 매체의 1.5 mL를 추가하십시오. 4일째에, 재조합 인간 EGF로 보충된 성장 배지의 1.5 mL로 배지를 대체하고, 인슐린, 하이드로 코르티손, 에피네프린, T3, 트랜스 페이트랜스린, 15% 테트라사이클린 프리 FBS, 0.5% L-알라닌-L-글루타민, 0.5% 비필수 아미노산, 2.5 ng/mL 섬유아세포 성장 인자 기본 (bFGF), 재조합 인간 혈소판 유래 성장 인자 (PGF), 격일로 성장 매체를 변경합니다.참고: UDC 콜로니는 1주일 이내에 나타납니다. UDC 배양이 80-90% 동시성이 되면, PBS로 배지와 세척 세포를 제거하고, 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 모든 세포를 분할하고 3,000-5,000세포/cm2에서 씨앗을 새로운 젤라틴 코팅 60 mm 접시(passage 1)에.참고: UdCs는 액체 질소에 보관할 수 있습니다. UdC는 일반적으로 60mm 배양 접시에서 60-70 % 동률로 3 개의 스톡 튜브로 나뉩니다. 2. 레트로 바이러스 구조 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 MYOD1(NM_002478.4) 플라스미드의 코딩 영역을 증폭시다.참고: 열 사이클러에 대한 MYOD1 증폭 및 조건에 대한 혼합물은 각각 표 1 및 표 2에나타내고 있다. 증폭된 PCR 생성물의 1 μL을 사용하여 약 1,000 bp 크기의 단일 대역을 0.7% agarose 겔 전기동동을 검출하여 MYOD1 서열이 성공적으로 증폭되는지 확인한다. 청소 키트를 사용하여 PCR 제품을 청소하고 분광광도계로 농도를 결정합니다. 표 3에 도시된 바와 같이 혼합물을 37°C에서 하룻밤 동안 테트온 시스템 및 푸로마이신 내성 유전자를 다중 클로닝 부위에서 효소 표적 화된 영역으로 소화한다. 소화된 생성물의 1 μL을 사용하여 0.7% 아가로즈 겔 전기동동아에 의해 단일 밴드를 검출하여 레트로바이러스 벡터가 성공적으로 소화되었다는 것을 확인하였다. 정화 키트를 사용하여 소화 된 제품을 청소하고 분광광도계에 의해 농도를 결정합니다. 증폭된 MYOD1 단편(단계 2.1-2.3에 의해 생성됨)을 소화된 레트로바이러스 벡터(단계 2.4-2.6에 의해 생성됨)로 복제하기 위해, 인융합 클로닝 반응을 수행한다. 표 4에나타낸 바와 같이 반응을 설정하고, 50°C에서 15분 동안 반응을 배양한 다음, 얼음 위에 놓는다. 제조업체의 지침(재료 표)에따라 대장균 유능한 세포를 사용하여 변형을 수행하십시오. 10 g/L 바토 트립톤, 5 g/L 바토 효모 추출물, 5 g/L NaCl, 15 g/L 바토 한천, 50 mg/L 암피실린으로 구성된 LB 배양 판에 배양하여 형질전환된 유능한 세포를 선택합니다. 37°C에서 200 rpm에서 박토 한천 없이 LB 배양 배지에서 선택된 콜로니 및 배양을 하룻밤 동안 픽업한다. 플라스미드 정제키트(표재료)를 사용하여 MYOD1-삽입된레트로바이러스 벡터를 정화하고 분광광도계를 사용하여 정량화한다. 삽입된 MYOD1 서열을 통해 양측에 각각 표적화된 전진 및 후진 프라이머에 의해 증폭된 PCR 제품의 직접 시퀀싱에 의해 MYOD1이 레트로바이러스 벡터에 올바르게 삽입되었는지 확인한다.참고: MYOD1 서열은 융합 복제가 성공할 때 레트로바이러스 벡터 서열 사이에 끼어 있는 것을 검출할 수 있다. 레트로바이러스 생산을 위해, 10cm 콜라겐 코팅 플레이트에 50,000세포/cm2에서 포장 세포를 시드하고 DMEM에서 배양하여 10% FBS를 37°C에서 가습하고 24시간 동안 5%CO2를 가습하였다. 패키징 세포가 80% 동률로 증식할 때, MYOD1-삽입된레트로바이러스 벡터30 μg, 30 μg의 포장 벡터 및 세포 침투 펩타이드를 함유하는 형질감염 시약(표오브 머티리얼)을와류에 의해 10분 동안 배양한다. 배양된 혼합물을 37°C 및 5%CO2에서가습한 포장 세포 및 배양배지에 첨가한다.참고 : 콜라겐 코팅이 필요합니다. 패키징 세포가 배양 플레이트로부터 용이하게 분리되기 때문에 파종 후 24시간 이상에서 형질감염이 더 좋을 수 있다. 4 시간 또는 하룻밤 후, 신선한 성장 매체로 매체를 변경합니다. 바이러스 상류를 수집하고 24 및 48 시간 에서 신선한 매체로 교체하고 상류를 결합합니다. 바이러스 상류를 농축하려면 농축기 시약과 혼합하여 밤새 37 °C에서 배양한 다음 4 °C에서 45 분 동안 1,500 x g에서 원심 분리합니다. 0.45 μm 기공으로 PVDF 필터를 통해 레트로 바이러스 상급자를 걸. 제조업체의 지침에 따라 정량적 PCR 키트 및 열 사이클러 시스템을 사용하여 레트로 바이러스 벡터의 역가를 확인하십시오. 바이러스 상급을 작은 알리쿼트로 나누고 -80 °C에서 비축하십시오. 3. UDCs에서 MYOD1-레트로 바이러스 벡터감염 젤라틴 코팅 60mm 접시에 3,000-5,000 세포 / cm2에서 UdC를 씨앗. 24 시간 의 파종 후, 8 μg / mL의 농도에서 헥사디메트린 브로마이드를 첨가하여 200의 감염의 복합성에서 해동 된 레트로 바이러스 (단계 2.21)를 감염시. 37°C 및 5%CO2에서24시간 배양한 후, MYOD1-트랜스듀싱세포를 선택하기 위해 1 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 신선한 성장 배지로 배양 배지를 대체한다. 격일로 매체를 변경합니다.참고 : MYOD1-양성 세포를 선택할 때, 1 μg / mL puromycin은 일반적으로 선택에 사용됩니다. 적절한 용량을 결정해야합니다. 전광혈이 함유된 플레이트를 사용하고 3-5일 만에 모든 세포를 죽이는 복용량을 선택하십시오. MYOD1-양성 세포는 푸로 마이신을 첨가 한 후 7-10 일 이내에 선택해야합니다. MYOD1-트랜스듀시 드우드Ic는 액체 질소에 저장될 수 있습니다. 4. MYOD1-트랜스듀싱 된 UdCs의 균질 분화 3-데자네 플라노신 A 염산염 (DZNep) 참고: 최근에는 히스톤 메틸트랜스퍼라제 억제제인 DZNep가 후기 근육 조절 요인 중 하나인 MYOGENIN의발현을 현저하게 촉진하고 myotube 분화7을유도할 수 있다고 보고되었습니다. 플레이트 MYOD1-3.5 x 104 세포 /cm2의밀도로 콜라겐 코팅 웰에서 DDC를 변환. 배양은 37°C 및 5%CO2에서가습된다. 24 시간 후, L-알라닌-L-글루타민, 5% 말 혈청, ITS 보충, 1 μg/mL 독시사이클린, 5 μM DZNep로 구성된 고포도당 DMEM으로 구성된 성장 배지를 분화 배지로 변경합니다.참고: 10 mM DZNep 용액은 3개월 동안 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 해동 냉동고를 사용하고 반복되는 동결 해동 주기를 피하십시오. 독시사이클린과 DZNep에 의해 활성화된 MYOD1은 모두 증식을 억제하고 UdC의 근생 분화를 촉진한다. 따라서, 독시 사이클린과 DZNep는 myogenic 분화의 유도 후에 추가되는 것이 좋습니다. DZNep는 투여량 의존적 방식으로 MYOD1-UDCs의근생 분화를 촉진한다. 한편, 고농도에서 세포독성을 나타낸다. 따라서, 균질성 분화 및 세포 생체 이용률에 미치는 영향에 따라 1-10 μM에 이르는 DZNep의 적절한 농도를 결정한다. 3일 후, DZNep 없이 분화 배지를 신선한 분화 매체로 변경한다. 그런 다음 3 일마다 매체를 변경합니다.참고: UDC는 서로 융합하고 분화 후 1-2주 이내에 myotube를 형성합니다. 5. MYOD1에서건너 뛰는 엑슨 -변환 된 UdCs 참고: 여기서, 3개의 프로토콜은 환자 유래 세포에서 엑온 건너뛰기를 평가하기 위해 기술된다: 1) 역사체 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)의 디스트로핀 mRNA; 2) 웨스턴 블롯에 의한 복원된 디스트로핀 단백질 신호의 반정질화; 및 3) 면역 세포 화학에 의한 복원 된 디스트로핀 형광 신호의 반정질화. 모든 방법은 용량 의존적 방식으로 엑슨 건너 뛰는 것을 검출 할 수 있습니다. RT-PCR에 의한 엑온 건너뛰기 효율성 평가 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 MYOD1-변환된UdCs를 분화 후 7일째에 DMD 환자로부터 수득한 DDC를 트랜스펙트하기 위해, 혼합 ASO, 형질감염 시약(표의 물질)및 분화 배지를 최종 농도로 1-10 μM. 배양가 37°C 및 5%CO2로가습하였다. ASO로 72시간 배양한 후, ASO 없이 배지를 신선한 분화 매체로 바꾼다. ASO 변형 후 3-7 일에서 분화 매체를 제거하고 PBS로 1x를 씻으하십시오. 세포 용해 완충액을 추가하고 UDC를 용해시키고 RNA 추출 키트를 사용하여 전체 RNA를 수확합니다. 분광광도계로 RNA 농도를 측정합니다. 표 5에따라 PCR 튜브에서 1 단계 RT-PCR 반응에 필요한 시약을 결합합니다. 혼합물과 함께 PCR 튜브를 열자전거에 놓습니다. 표 6에따라 열자전거를 실행합니다. 마이크로칩 전기 영동을 수행하고 아래와 같이 어금니 농도를 사용하여 엑온 건너뛰기 효율을 계산합니다.Exon 건너뛰기 효율 (%) = 건너뛴 밴드 / (건너뛴 밴드 + 건너 뛴 밴드) x 100참고: PCR 제품을 단기 보관을 위해 4°C 또는 장기 보관을 위해 -20°C의 냉장고에 보관하십시오. 서양 블로팅에 의해 건너 뛰는 엑소 후 디스트로핀의 검출 5.1.1 단계 및 5.1.2 단계에 따라 ASO 및 배양 MYOD1-UdCs를 트랜스펙트합니다. 3일마다 매체를 변경합니다. 분화 2주 후, 프로테아제 억제제가 함유된 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액을 사용하여 배양된 세포로부터 총 단백질을 추출한다. 4 °C에서 15 분 동안 14,000 x g에서 얼음과 원심 분리기에 용해를 초음파 처리하십시오. 상급체를 수집하고 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다. 0.5 mL 튜브에 총 단백질 15 μg를 추가하고 프로테아제 억제제가 함유된 RIPA 버퍼를 총 부피 10 μL에 첨가하여 희석합니다. 표 7에나타낸 바와 같이 샘플 버퍼, 환원제 및 탈이온수를 추가한다. 세포가 70 °C에서 10 분 동안 용해됩니다. 8.95 g/L 트리신, 6.06 g/L 트리스 베이스, 1.0 g/L 나트륨 도데실 황산염(SDS)을 함유한 트리스 아세테이트 러닝 버퍼를 준비합니다. 샘플(20 μL)을 트리스 아세테이트 3−8% 겔에 적재하고 75분 동안 150V에서 전기 영동을 수행합니다. 메탄올없이 블로팅 버퍼를 준비합니다. PVDF 멤브레인을 메탄올에 20초 간 담근 다음 블롯 버퍼에 넣고 사용 후(최소 10분) 담그십시오. 미니 젤을 사용하여 PVDF 멤브레인을 6 x 8cm 크기로 자르고 미디 젤을 사용하여 8 x 12cm로 자른다. 블로팅 용지를 PVDF 멤브레인의 크기와 동일한 크기로 자르고 사용할 때까지 블로팅 버퍼에 담그십시오. 전기 동동 후, PVDF 멤브레인의 것과 동일한 크기로 겔을 자르고 증류수에 겔을 담급니다. 블로팅 페이퍼, PVDF 멤브레인 및 겔을 반건조 전달 장치에 놓습니다(그림1). 4 mA/cm2에서 30분 동안 옮김을 드시면 됩니다. 증류수로 멤브레인을 2x 헹구어 내보소서. 1차 항체로서 항디스트로핀(1:500) 및 항α-tubulin(1:1,200) 항체를 준비한다. HRP-이컨쥬게이트 항마우스 항체(1:100)를 이차 항체로서 준비한다. 1 차 항체로 막을 배양하고 세척 버퍼로 씻은 다음 실온에서 자동화 된 서양 처리 장치(재료 표)를사용하여 이차 항체로 배양하십시오.참고: 항α-tubulin 항체는 일반적으로 로딩 제어로 사용된다. 1:500 항-디스트로핀 및 1:1,200 항α-tubulin 항체를 포함하는 혼합된 1차 항체 용액은 항체 반응이 동시에 수행될 때 잘 작동한다. 멤브레인을 증류수로 헹구어 보시킵니다. 화학 발광 검출 시약 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 기반 이미저를 사용하여 단백질을 검출합니다. 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 면역 세포 화학에 의해 건너 뛰는 엑소 후 디스트로핀의 검출 4.1-4.3 단계에 따라 콜라겐 코팅 된 96 웰 플레이트에서 Myotube에 UdC를 직접 다시 프로그래밍하십시오. 5.1.2 단계 및 5.1.3 단계에 따라 ASO 및 배양 MYOD1-UdCs를 트랜스펙트합니다. 분화 2 주 후, PBS로 세포를 세척하고 4 °C에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. 0.1% MYOD1요오닉 세제에 0.1% nonionic 세제를 실온에서 10분 동안 투과하고 37°C에서 15분 동안 10% 염소 혈청을 가진 세제를 차단합니다. 4°C에서 1차 항체로 밤새 세포를 배양한다. PBS로 세포를 세척하고 실온에서 30 분 동안 이차 항체로 인큐베이션하십시오.참고: 여기서, 마우스 항-디스트로핀(1:30)은 1차 항체로서 사용되고, 항마우스 IgG는 이차 항체로서 사용되고, Hoechst(1:10,000)는 핵 염색에 사용된다. 형광 현미경을 사용하여 플레이트를 이미지화하고 분석기를 사용하여 동일한 조건하에서 모든 우물에서 형광 신호를 자동으로 반정화합니다.