Использование замороженных оттаять эмбрионов для высокоэффективного производства генетически модифицированных мышей

Кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR)/CRISPR-ассоциированный белок 9 (Cas9) система является научным прорывом, который обеспечивает беспрецедентную целевую модификацию в^{геноме 1}. Система CRISPR/Cas9 состоит из белка Cas9 и направляющей РНК (gRNA) с двумя молекулярными компонентами: целевой РНК CRISPR (crRNA) и трансактивировавской РНК CRISPR (tracrRNA)² . GRNA направляет белок Cas9 к специфическому локусу в геноме, 20 нуклеотидам, дополняют crRNA и примыкают к смежным мотивам протосказера (PAM). Cas9 белка связывается с целевой последовательности и вызывает двойные проломы (DSBs), которые восстанавливаются либо ошибка подверженных nonhomologous конец присоединения (NHEJ) или высокой точности гомологии направлены ремонт (HDR)^3,4,5. NHEJ приводит к вставкам или/и удалениям (индельям) и, следовательно, к потере функции гена при целевой последовательности кодирования. HDR приводит к точному редактированию генома в присутствии шаблона ремонта, содержащего амологические последовательности^3,,4,,5. NHEJ и HDR были использованы для создания нокаута и стук в мышей, соответственно.

В то время как система CRISPR/Cas9 заметно ускорила генерацию ГМ-мышей с выдающейся эффективностью и точностью, ученые, применяющие эти методы, часто сталкиваются с техническими проблемами. Во-первых, обычные протоколы требуют микроинъекции для внедрения инструментов редактирования CRISPR в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток^6,,7. Этот метод занимает много времени и обычно требует обширной подготовки. Таким образом, несколько групп заменили микроинъекцию электропорацией^{88,9,,10,,11,,12,,13.} Однако в ранних протоколах электропорации для электропорации использовались свежие эмбрионы. Это вызвало еще одну проблему, потому что подготовка свежих эмбрионов перед каждым экспериментом трудно¹⁴.

Недавно мы и другие объединили использование замораживающих оттепели эмбрионов и электропорации для редактирования генома, что облегчает генерацию ГМ мышей^15,16. Этот протокол позволяет исследователям без предварительных искусств манипуляции зародыша быстро произвести животные модели людских заболеваний с высокой эффективностью. Протокол также значительно снижает практические проблемы в генерации ГМ мышей, такие как генетическая неоднородность у основателей¹⁶. Чтобы преодолеть мозаичность, мы выполняем электропорацию реагентов CRISPR в течение 1 ч после оттаивания эмбриона, чтобы обеспечить редактирование до первой репликации генома. Другое улучшение включает в себя использование белка Cas9 вместо Cas9 мРНК для уменьшения нежелательных мозаики¹⁷. Кроме того, мы разработали оптимальный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов, который увеличивает скорость развития до двухклеточной стадии¹⁶: использование сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) значительно улучшает выживаемость замороженных оттаять яоцитов после оплодотворения, возможно, тем же механизмом, который делает замораживание оттаяли неоплодное ооциты более^{устойчивыми.}

Здесь мы представляем всеобъемлющий протокол для генерации ГМ-мышей с использованием замороженных оттаять эмбрионов, в том числе модифицированный метод криоконсервации одноклеточных эмбрионов C57BL/6J. Она включает в себя 1) дизайн gRNA, подготовку реагента CRISPR и сборку; 2) ЭКО, криоконсервация и оттаивание одноклеточных эмбрионов; 3) Электропорация реагентов CRISPR в замораживание оттаяли эмбрионов; 4) Перенос эмбриона в яйцеклетку псевдобеременных самок мышей; и 5) Генотипирование и анализ последовательности животных-основателей F0.