Быстрый метод многоспектральной флуоресценции Визуализация замороженных секций тканей

Последние достижения в области микроскопических методов визуализации значительно улучшили наши знания и понимание биологических процессов и состояний болезней. При анализе белков в тканях с помощью хромогенной иммуногистохимии (МГК) обычно проводится при патологии. Тем не менее, обнаружение нескольких маркеров с использованием хромогенных iHC окрашивания является сложной^{задачей 1} и новые методы для использования мультиплекс иммунофлуоресценции (mIF) окрашивания подходов, в котором несколько биологических маркеров помечены на одном образце ткани, разрабатываются. Обнаружение нескольких биологических маркеров полезно, потому что информация, связанная с архитектурой тканей, пространственным распределением клеток и антигеном, все они запечатлены в одной образце ткани^2. Использование многоспектральной технологии визуализации флуоресценции сделало возможным обнаружение нескольких биологических маркеров. В этой технологии, используя определенную оптику флуоресценции спектры каждого отдельного флюорофора могут быть разделены или “несмешанные”, что позволяет обнаружение нескольких маркеров без каких-либо спектральных^{перекрестного}3 . Многоспектральная флуоресценция становится критическим подходом в клеточной биологии, доклиническом развитии лекарственных средств, клинической патологии и иммунном профилировании опухоли^4,,5,6. Важно отметить, что пространственное распределение иммунных клеток (в частности, CD8 Т-клеток) может служить прогностическим фактором для пациентов с существующими опухолями⁷.

Разработаны различные подходы к расклеиванию мультиплексной флуоресценции, которые могут выполняться одновременно или последовательно. В методе одновременного окрашивания все антитела добавляются вместе, как коктейль в один шаг, чтобы обозначить ткани. Технология UltraPlex использует коктейль из хаптен-конъюгированных первичных антител, за которым и коктейль из флюорофора-конъюгированных анти-хаптеновых вторичных антител. Технология InSituPlex⁸ использует коктейль из уникальных ДНК-конъюгированных первичных антител, которые одновременно добавляются в ткани с последующим шагом усиления и, наконец, флюорофор-конъюгированными зондами, которые дополняют каждую уникальную последовательность ДНК на первичном антителе. Обе эти технологии позволяют обнаружить четыре маркера плюс 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) для ядерного окрашивания. Два других подхода к одновременному окрашиванию мультиплексного окрашиваемого основанного на вторичной ионной масс-спектрометрии⁹. Система визуализации Hyperion использует цитометрию массы изображения¹⁰ для обнаружения до 37 маркеров. Эта технология использует коктейль из металлических конъюгированных антител, чтобы запятнать ткани, а определенные участки тканей абляции лазером и передаются в массовый цитометр, где обнаружены ионы металла. Другой аналогичной технологией является IONPath, который использует мультиплексный ионный луч изображения технологии¹¹. Эта технология использует модифицированный инструмент масс-спектрометрии и источник ионного кислорода вместо лазера, чтобы абляции металлических конъюгированных антител. В то время как все эти одновременные мультиплексные подходы к окрашиванию позволяют обнаруживать несколько маркеров, нельзя недооценивать затраты на спряжение ДНК, гастенили или металлов к антителам, потерю ткани из-за абляции и обширную обработку изображений для несмешивания. Кроме того, комплекты и протоколы окрашивания в настоящее время доступны только для тканей FFPE и разработка пользовательских панелей влечет за собой дополнительное время и расходы.

Последовательный метод окрашивания мультиплексов, напротив, включает в себя маркировку ткани антителом к одному маркеру, зачистку для удаления антител, а затем последовательные повторы этого процесса для обозначения нескольких маркеров¹². Усиление сигнала тирамад (TSA) является наиболее часто используемым методом последовательного мультиплексирования. Две другие технологии мультиплексирования используют сочетание одновременных и последовательных методов окрашивания. Платформа CODEX¹³ использует коктейль антител, спрягаемых с уникальными последовательностями олигонуклеотидов ДНК, которые в конечном итоге помечены флюорофором с помощью индексируемого шага полимеризации, за которым следуют визуализация, зачистка и повторение процесса обнаружения до 50 маркеров. Мультиомикс мультиплексок окрашивания подход¹⁴ является итерация окрашивания с коктейлем из трех-четырех флюорофор-конъюгированных антител, изображения, угасание фторфоров, и повторение этого цикла для обнаружения до 60 маркеров на одном разделе. Подобно методу одновременного мультиплексного окрашивания, в то время как широкий спектр маркеров может быть обнаружен, время, связанное с окрашиванием, приобретением изображений, обработкой и анализом, обширено. Зачистка / закалка шаг включает в себя отопление и / или отбеливание образца ткани и, таким образом, последовательный мультиплекс окрашивания подход обычно осуществляется на ткани FFPE, которые поддерживают целостность тканей при нагревании или отбеливание.

Формалин фиксации и последующего встраивания парафина легко выполняется в клинических условиях, ткани блоки легко хранить, и несколько протоколов мультиплекс окрашивания доступны. Тем не менее, обработка, встраивание и депарафинизация тканей FFPE, а также антигена поиска¹⁵, процесс, с помощью которого антитела могут лучше получить доступ к эпитопам, занимает много времени. Кроме того, обработка, связанная с тканями FFPE, способствует аутофлуоресценции¹⁶ и маски целевых эпитопов, что приводит к изменчивости и отсутствию клона антител, доступных для обнаружения антигенов в тканях FFPE^17,18,19. Примером является человеческий лейкоцит антиген (HLA) класса я аллелей²⁰. В отличие от этого, оснастки замораживания тканей не включает в себя обширные шаги обработки до или после фиксации, в обход необходимости поиска антигена^21,22, и делает его полезным для обнаружения более широкого круга целей. Поэтому использование замороженных тканей для многоспектральной флуоресценции может быть полезным для выявления целей для доклинических и клинических исследований.

Учитывая вышеупомянутые ограничения при использовании тканей FFPE, мы спросили, можно ли проводить многоспектральную флуоресценцию на замороженных тканях. Для решения этого вопроса мы протестировали метод одноразового мультиплексного окрашивания с помощью панели флюорофор-конъюгированных антител для обнаружения нескольких антигенов и проанализировали окрашивание с помощью полуавтоматической многоспектральной системы визуализации. Мы смогли одновременно пятно до шести маркеров в одной секции ткани в течение 90 минут.