Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Recente ontwikkelingen in microscopische beeldvormingstechnieken hebben onze kennis en begrip van biologische processen en ziektetoestanden aanzienlijk verbeterd. In situ detectie van eiwitten in weefsels via chromogene immunohistochemie (IHC) wordt routinematig uitgevoerd in pathologie. Echter, detectie van meerdere markers met behulp van chromogene IHC kleuring is uitdagend¹ en nieuwere methoden om multiplex immunofluorescentie (mIF) kleuring benaderingen te gebruiken, waarbij meerdere biologische markers worden gelabeld op een enkel weefsel monster, worden ontwikkeld. De detectie van meerdere biologische markers is nuttig, omdat informatie met betrekking tot weefselarchitectuur, ruimtelijke verdeling van cellen en antigeenco-expressie allemaal worden vastgelegd in één weefselmonster^2. Het gebruik van multispectrale fluorescentiebeeldvormingstechnologie heeft detectie van meerdere biologische markers mogelijk gemaakt. In deze technologie kan met behulp van specifieke optiek de fluorescentiespectra van elke afzonderlijke fluorophore worden gescheiden of “ongemengd”, waardoor meerdere markers kunnen worden gedetecteerd zonder spectrale kruisspraak³. Multispectrale fluorescentiebeeldvorming wordt een kritische benadering in de celbiologie, preklinische medicijnontwikkeling, klinische pathologie en tumorimmuunprofilering^4,5,6. Belangrijk is dat de ruimtelijke verdeling van immuuncellen (met name CD8 T-cellen) kan dienen als een prognostische factor voor patiënten met bestaande tumoren⁷.

Verschillende benaderingen van multiplex fluorescentie kleuring zijn ontwikkeld en kan gelijktijdig of sequentieel worden uitgevoerd. In de simultaan kleuringmethode worden alle antilichamen als cocktail in één stap bij elkaar opgeteld om het weefsel te labelen. UltraPlex-technologie maakt gebruik van een cocktail van hapten-geconjugeerde primaire antilichamen, gevolgd door een cocktail van fluorophore-geconjugeerde anti-hapten secundaire antilichamen. InSituPlex technologie⁸ maakt gebruik van een cocktail van unieke DNA-geconjugeerde primaire antilichamen die tegelijkertijd worden toegevoegd aan het weefsel, gevolgd door een versterking stap en ten slotte fluorophore-geconjugeerde sondes die complementair zijn aan elke unieke DNA-sequentie op het primaire antilichaam. Beide technologieën maken de detectie van vier markers plus 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) voor nucleaire kleuring mogelijk. Twee andere benaderingen voor gelijktijdige multiplex kleuring zijn gebaseerd op secundaire ionenmassaspectrometrie⁹. Het Hyperion Imaging System maakt gebruik van beeldmassacytometrie¹⁰ om tot 37 markers te detecteren. Deze technologie maakt gebruik van een cocktail van met metaal geconjugeerde antilichamen om de weefsels te bevlekken, en specifieke gebieden van de weefsels worden door een laser ontdaan en overgebracht naar een massacytometer waar de metaalionen worden gedetecteerd. Een andere soortgelijke technologie is de IONPath, die multiplexed ionbeam imaging technologie^{gebruikt 11}. Deze technologie maakt gebruik van een gemodificeerde massaspectrometrie instrument en een zuurstof ionen bron in plaats van laser om de metaal-geconjugeerde antilichamen ablate. Hoewel al deze gelijktijdige multiplex vlekken benaderingen de detectie van meerdere markers mogelijk te maken, de kosten die betrokken zijn voor het conjugeren van DNA, haptens, of metalen aan antilichamen, het verlies van weefsel als gevolg van ablatie, en de uitgebreide beeldverwerking voor het niet mengen van de mengmenging kan niet worden onderschat. Bovendien zijn kits en kleuringprotocollen momenteel alleen beschikbaar voor FFPE-weefsels en brengt het ontwikkelen van aangepaste panelen extra tijd en uitgaven met zich mee.

De sequentiële multiplex kleuring methode, in tegenstelling, omvat het etiketteren van het weefsel met een antilichaam aan een marker, strippen om het antilichaam te verwijderen, gevolgd door opeenvolgende herhalingen van dit proces om meerdere markers label¹². De tyramide signaalversterking (TSA) is de meest gebruikte sequentiële multiplexing methode. Twee andere multiplexing technologieën maken gebruik van een combinatie van gelijktijdige en sequentiële kleuring methoden. De CODEX platform¹³ maakt gebruik van een cocktail van antilichamen geconjugeerd om unieke DNA oligonucleotide sequenties die uiteindelijk worden gelabeld met een fluorophore met behulp van een geïndexeerde polymerisatie stap gevolgd door beeldvorming, strippen, en het herhalen van het proces om te detecteren tot 50 markers. De MultiOmyx multiplex kleuring aanpak¹⁴ is een iteratie van vlekken met een cocktail van drie tot vier gefluorofe-geconjugeerde antilichamen, beeldvorming, het doven van de fluorophoren, en het herhalen van deze cyclus te detecteren tot 60 markers op een enkele sectie. Vergelijkbaar met de gelijktijdige multiplex kleuring methode, terwijl een breed scala van markers kan worden gedetecteerd, de tijd die betrokken zijn bij kleuring, beeldverwerving, verwerking, en analyse is uitgebreid. De strippen / blussen stap omvat verwarming en / of bleken van het weefsel monster en dus, de sequentiële multiplex kleuring aanpak wordt vaak uitgevoerd op FFPE weefsels die weefsel integriteit te handhaven bij het verwarmen of bleken.

Formaline fixatie en daaropvolgende paraffine inbedding wordt gemakkelijk uitgevoerd in een klinische omgeving, weefselblokken zijn gemakkelijk op te slaan en verschillende multiplex kleuringprotocollen zijn beschikbaar. Echter, de verwerking, inbedding, en deparaffinisatie van FFPE weefsels, evenals antigeen ophalen¹⁵, een proces waarbij antilichamen beter toegang epitopes, is tijdrovend. Bovendien draagt de verwerking van FFPE-weefsels bij tot autofluorescentie¹⁶ en maskers op epitopen, wat resulteert in de variabiliteit en het gebrek aan antilichaamkloon die beschikbaar is om antigenen in FFPE-weefsels op te sporen^17,18,19. Een voorbeeld is de menselijke leukocyteantigeen (HLA) klasse I alleles²⁰. In tegenstelling, snap bevriezing van weefsels omvat geen uitgebreide verwerking stappen voorafgaand aan of na de vaststelling, het omzeilen van de noodzaak voor antigeen terugwinning^21,22, en waardoor het gunstig is voor het opsporen van een breder scala van doelen. Daarom kan het gebruik van bevroren weefsels voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming waardevol zijn om doelen voor preklinische en klinische studies te detecteren.

Gezien de bovengenoemde beperkingen bij het gebruik van FFPE weefsels, vroegen we of multispectrale fluorescentie beeldvorming kan worden uitgevoerd op bevroren weefsels. Om deze vraag aan te pakken, hebben we een gelijktijdige multiplex kleurmethode getest met behulp van een paneel van gefluorofe-geconjugeerde antilichamen om meerdere antigenen te detecteren en analyseerden we de kleuring met behulp van een semi-geautomatiseerd multispectral imaging systeem. We waren in staat om tegelijkertijd vlek tot zes markers in een enkel weefsel sectie binnen 90 min.