Utvikling av en Larval Zebrafish Infeksjon Modell for Clostridioides difficile

C. difficile er en gram-positiv, sporedannende, anaerob og toksinproduserende bacillus som er den ledende årsaken til alvorlige infeksjoner i mage-tarmkanalen¹. Typiske symptomer på CDI inkluderer diaré, magesmerter og dødelig pseudomembranøs kolitt, og det kan noen ganger føre til død^1,2. Bevis har vist at vertenimmunresponser spiller en kritisk rolle i både progresjonen og utfallet av denne sykdommen³. I tillegg til immunresponsen er urbefolkningens tarmmikrobiota avgjørende for utbruddet og patogenesen til CDI⁴. I det siste tiåret har både antall tilfeller og dødeligheten av CDI økt betydelig på grunn av fremveksten av en hypervirulent stamme av C. difficile (BI/NAP1/027)^5,6. En bedre forståelse av underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidra til nye terapeutiske utviklinger og fremskritt, noe som gir bedre kontroll over denne epidemien.

Flere dyremodeller, som hamster og mus, har blitt utviklet for å gi innsikt i immunforsvaret mot C. vanskelig^7,8. Imidlertid er rollen til medfødte immunceller fortsatt dårlig forstått, spesielt siden medfødt immuncelleatferd hovedsakelig er avledet fra histologisk analyse eller kultiverte celler in vitro. Derfor vil det å etablere en gjennomsiktig sebrafiskmodell for å avsløre den medfødte immunresponsen mot C. vanskelig inne i en levende virveldyrorganisme legge til rette for slike studier. Sebrafisk larver har et funksjonelt medfødt immunsystem, men de mangler det adaptive immunforsvaret til 4-6 uker etter befruktning⁹. Denne unike funksjonen gjør sebrafisk larver en utmerket modell for å studere den isolerte responsen og funksjonen til medfødte immunceller i CDI.

Denne rapporten beskriver nye metoder ved hjelp av sebrafisk larver for å studere interaksjonene mellom C. vanskelig og medfødte immunceller, som makrofager og nøytrofiler. For det første presenteres en lokalisert mikroinjeksjonsprotokoll som inkluderer C. difficile inoculum og farging. Ved hjelp av in vivo-konfokal time-lapse-avbildning registreres responsen av nøytrofiler og makrofager mot infeksjonsstedet, og fagocytose av bakterier av nøytrofiler og makrofager observeres. Det har imidlertid blitt rapportert at injeksjonen i seg selv forårsaker vevsskade og fører til rekruttering av leukocytter uavhengig av bakteriene¹⁰. Derfor beskrives en ikke-invasiv mikrogavageprotokoll for å levere C. difficile inn i tarmen av sebrafisklarver senere. Tidligere studier har vist at urfolk gastrointestinal mikrobiota beskytte en vert mot kolonisering av C. vanskelig¹¹. Derfor brukes gnotobiotiske sebrafisk larver også til å predisponere sebrafisken som er smittet ¹². Etterpå utføres tarmdisseksjon for å gjenopprette levedyktig C. vanskelig og validere varigheten av deres tilstedeværelse i sebrafisk tarmkanaler.