Presentert her er en sikker og effektiv metode for å infisere sebrafisk larver med fluorescerende merket anaerob C. vanskelig ved mikroinjeksjon og ikke-invasiv mikrogavage.
Clostridioides difficile infeksjon (CDI) anses å være en av de vanligste helse-assosierte gastrointestinale infeksjoner i USA. Den medfødte immunresponsen mot C. difficile er beskrevet, men de eksakte rollene til nøytrofiler og makrofager i CDI er mindre forstått. I den nåværende studien brukes Danio rerio (sebrafisk) larver til å etablere en C. vanskelig infeksjonsmodell for å forestille seg oppførselen og samarbeidet til disse medfødte immuncellene in vivo. For å overvåke C. vanskelig, en merking protokoll ved hjelp av en fluorescerende farge er etablert. En lokalisert infeksjon oppnås ved mikroinsprøyting merket C. difficile, som aktivt vokser i sebrafisk tarmkanalen og etterligner tarmepitelskaden i CDI. Denne direkte infeksjonsprotokollen er imidlertid invasiv og forårsaker mikroskopiske sår, noe som kan påvirke eksperimentelle resultater. Derfor er en mer ikke-invasiv mikrogavage protokoll beskrevet her. Metoden innebærer levering av C. difficile celler direkte inn i tarmen av sebrafisk larver ved intubasjon gjennom åpen munn. Denne infeksjonsmetoden etterligner nøye den naturlige infeksjonsruten til C. vanskelig.
C. difficile er en gram-positiv, sporedannende, anaerob og toksinproduserende bacillus som er den ledende årsaken til alvorlige infeksjoner i mage-tarmkanalen1. Typiske symptomer på CDI inkluderer diaré, magesmerter og dødelig pseudomembranøs kolitt, og det kan noen ganger føre til død1,2. Bevis har vist at vertenimmunresponser spiller en kritisk rolle i både progresjonen og utfallet av denne sykdommen3. I tillegg til immunresponsen er urbefolkningens tarmmikrobiota avgjørende for utbruddet og patogenesen til CDI4. I det siste tiåret har både antall tilfeller og dødeligheten av CDI økt betydelig på grunn av fremveksten av en hypervirulent stamme av C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bedre forståelse av underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidra til nye terapeutiske utviklinger og fremskritt, noe som gir bedre kontroll over denne epidemien.
Flere dyremodeller, som hamster og mus, har blitt utviklet for å gi innsikt i immunforsvaret mot C. vanskelig7,8. Imidlertid er rollen til medfødte immunceller fortsatt dårlig forstått, spesielt siden medfødt immuncelleatferd hovedsakelig er avledet fra histologisk analyse eller kultiverte celler in vitro. Derfor vil det å etablere en gjennomsiktig sebrafiskmodell for å avsløre den medfødte immunresponsen mot C. vanskelig inne i en levende virveldyrorganisme legge til rette for slike studier. Sebrafisk larver har et funksjonelt medfødt immunsystem, men de mangler det adaptive immunforsvaret til 4-6 uker etter befruktning9. Denne unike funksjonen gjør sebrafisk larver en utmerket modell for å studere den isolerte responsen og funksjonen til medfødte immunceller i CDI.
Denne rapporten beskriver nye metoder ved hjelp av sebrafisk larver for å studere interaksjonene mellom C. vanskelig og medfødte immunceller, som makrofager og nøytrofiler. For det første presenteres en lokalisert mikroinjeksjonsprotokoll som inkluderer C. difficile inoculum og farging. Ved hjelp av in vivo-konfokal time-lapse-avbildning registreres responsen av nøytrofiler og makrofager mot infeksjonsstedet, og fagocytose av bakterier av nøytrofiler og makrofager observeres. Det har imidlertid blitt rapportert at injeksjonen i seg selv forårsaker vevsskade og fører til rekruttering av leukocytter uavhengig av bakteriene10. Derfor beskrives en ikke-invasiv mikrogavageprotokoll for å levere C. difficile inn i tarmen av sebrafisklarver senere. Tidligere studier har vist at urfolk gastrointestinal mikrobiota beskytte en vert mot kolonisering av C. vanskelig11. Derfor brukes gnotobiotiske sebrafisk larver også til å predisponere sebrafisken som er smittet 12. Etterpå utføres tarmdisseksjon for å gjenopprette levedyktig C. vanskelig og validere varigheten av deres tilstedeværelse i sebrafisk tarmkanaler.
De presenterte metodene endrer og utvider en eksisterende tilnærming for å infisere sebrafisk larver ved å utføre både injeksjon og mikrogavage10,14. Det demonstrerer også en tilnærming til å studere anaerobe patogener med sebrafisk larver22. I tillegg forenkler protokollen analysen av medfødte immuncelleresponser på CDI og ved kolonisering av C. vanskelig i sebrafisk. Metoden er reproduserbar og lett å gjennomføre i e…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til Timo Fritsch for utmerket dyrepleie. Vi takker medlemmene av Köster- og Steinert-laboratoriene for støtte og nyttige diskusjoner. Vi takker Dr. Dandan Han for kritisk lesing av manuskriptet. Vi anerkjenner takknemlig finansiering av den føderale delstaten Niedersachsen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
FIJI | open-source platform | Image processing | |
HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Yeast extract | BD Bacto | 212750 |