Développement d’un modèle d’infection par le poisson zèbre larvaire pour Clostridioides difficile
Summary
Présenté ici est une méthode sûre et efficace pour infecter les larves de poissons zèbres avec fluorescent étiqueté C. difficile anaérobie par microinjection et microgavage non invasif.
Abstract
L’infection à Clostridioides difficile (CDI) est considérée comme l’une des infections gastro-intestinales les plus courantes associées aux soins de santé aux États-Unis. La réponse immunitaire innée contre C. difficile a été décrite, mais les rôles exacts des neutrophiles et des macrophages dans CDI sont moins compris. Dans la présente étude, les larves de Danio rerio (poisson zèbre) sont utilisées pour établir un modèle d’infection À C. difficile pour l’imagerie du comportement et de la coopération de ces cellules immunitaires innées in vivo. Pour surveiller C. difficile, un protocole d’étiquetage à l’aide d’un colorant fluorescent a été établi. Une infection localisée est réalisée par micro-injection étiquetée C. difficile, qui se développe activement dans le tractus intestinal du poisson zèbre et imite les dommages épithéliales intestinaux dans cDI. Cependant, ce protocole d’infection directe est invasif et cause des blessures microscopiques, qui peuvent affecter des résultats expérimentaux. Par conséquent, un protocole de microgavage plus non invasif est décrit ici. La méthode consiste à aciver des cellules C. difficile directement dans l’intestin des larves de poissons zèbres par intubation par la bouche ouverte. Cette méthode d’infection imite étroitement la voie naturelle d’infection de C. difficile.
Introduction
C. difficile est un bacille gram-positif, spore-formant, anaérobie, et toxine-producteur qui est la principale cause des infections graves dans le tractus gastro-intestinal1. Les symptômes typiques de l’ICD comprennent la diarrhée, des douleurs abdominales et une colite pseudomembraneuse mortelle, et elle peut parfois entraîner la mort1,2. Les preuves ont montré que les réponses immunitaires de l’hôte jouent un rôle critique dans la progression et les résultats de cette maladie3. En plus de la réponse immunitaire, le microbiote intestinal indigène est crucial pour l’début et la pathogénie de CDI4. Au cours de la dernière décennie, le nombre de cas et le taux de mortalité de l’ICD ont considérablement augmenté en raison de l’émergence d’une souche hypervirulente de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires sous-jacents et du rôle du microbiote pendant l’ICD contribuera à la mise en place de nouveaux développements et progrès thérapeutiques, permettant ainsi un meilleur contrôle de cette épidémie.
Plusieurs modèles animaux, tels que le hamster et la souris, ont été développés pour donner un aperçu de la défense immunitaire contre C. difficile7,8. Cependant, le rôle des cellules immunitaires innées est encore mal compris, d’autant plus que le comportement inné des cellules immunitaires est principalement dérivé de l’analyse histologique ou des cellules cultivées in vitro. Par conséquent, l’établissement d’un modèle transparent de poisson zèbre pour révéler la réponse immunitaire innée à C. difficile à l’intérieur d’un organisme vertébré vivant facilitera de telles études. Les larves de poissons zèbres ont un système immunitaire inné fonctionnel, mais elles n’ont pas le système immunitaire adaptatif jusqu’à 4 à 6 semaines après la fécondation9. Cette caractéristique unique fait des larves de poissons zèbres un excellent modèle pour étudier la réponse et la fonction isolées des cellules immunitaires innées en CDI.
Ce rapport décrit de nouvelles méthodes utilisant des larves de poissons zèbres pour étudier les interactions entre les cellules immunitaires C. difficile et innées, telles que les macrophages et les neutrophiles. Tout d’abord, un protocole de microinjection localisé qui comprend l’inoculum c. difficile et la coloration est présenté. À l’aide de la formation image in vivo confocaltime lapse, la réponse des neutrophiles et des macrophages vers le site d’infection est enregistrée, et la phagocytose des bactéries par les neutrophiles et les macrophages est observée. Cependant, il a été rapporté que l’injection elle-même cause des dommages de tissu et mène au recrutement des leucocytes indépendants de la bactérie10. Par conséquent, un protocole de microgavage non invasif pour livrer C. difficile dans l’intestin des larves de poissons zèbres est décrit plus tard. Des études antérieures ont démontré que le microbiote gastro-intestinal indigène protège un hôte contre la colonisation de C. difficile11. Par conséquent, les larves de poissons zèbres gnotobiotiques sont également utilisées pour prédisposer les poissons zèbres qui sont infectés 12. Par la suite, la dissection intestinale est effectuée pour récupérer le C. difficile viable et valider la durée de leur présence dans les voies intestinales de poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes présentées modifient et étendent une approche existante pour infecter les larves de poissons zèbres en effectuant à la fois l’injection et le microgavage10,14. Il démontre également une approche pour étudier les agents pathogènes anaérobies avec les larves de poissons zèbres22. En outre, le protocole facilite l’analyse des réponses innées de cellules immunitaires in vivo sur CDI et sur la colonisation de …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à Timo Fritsch pour les excellents soins aux animaux. Nous remercions les membres des laboratoires de Kôster et Steinert pour leur soutien et leurs discussions utiles. Nous remercions le Dr Dandan Han d’avoir lu le manuscrit. Nous remercions le financement de l’Etat fédéral de Basse-Saxe, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
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