Desenvolvimento de um Modelo de Infecção de Zebrafish Larval para Clostridioides difficile
Summary
Apresentado aqui é um método seguro e eficaz para infectar larvas de zebrafish com c. anaeróbico fluorescente rotulado por microinjeção e microgavage não invasivo.
Abstract
A infecção por clostridioides difficile (CDI) é considerada uma das infecções gastrointestinais mais comuns associadas à saúde nos Estados Unidos. A resposta imune inata contra C. difficile foi descrita, mas os papéis exatos dos neutrófilos e macrófagos no CDI são menos compreendidos. No presente estudo, larvas de Danio rerio (zebrafish) são usadas para estabelecer um modelo de infecção por C. difficile para a imagem do comportamento e cooperação dessas células imunes inatas inatas inatas invivas. Para monitorar C. difficile, foi estabelecido um protocolo de rotulagem usando um corante fluorescente. Uma infecção localizada é alcançada pela microinjeção rotulada de C. difficile, que cresce ativamente no trato intestinal de zebrafish e imita o dano epitelial intestinal no CDI. No entanto, esse protocolo de infecção direta é invasivo e causa feridas microscópicas, que podem afetar os resultados experimentais. Assim, um protocolo microgavage mais não invasivo é descrito aqui. O método envolve a entrega de células C. difficile diretamente no intestino de larvas de zebrafish por intubação através da boca aberta. Este método de infecção imita de perto a rota de infecção natural de C. difficile.
Introduction
C. difficile é um bacilo produzido por esporos, anaeróbico e produtor de toxinas que é a principal causa de infecções graves no trato gastrointestinal1. Os sintomas típicos do CDI incluem diarreia, dor abdominal e colite pseudomembrannosa fatal, e às vezes pode levar à morte1,2. Evidências mostraram que as respostas imunes hospedeiras desempenham um papel crítico tanto na progressão quanto no resultado desta doença3. Além da resposta imune, a microbiota intestinal indígena é crucial para o início e a patogênese do CDI4. Na última década, tanto o número de casos quanto a taxa de mortalidade do DiEd aumentaram significativamente devido ao surgimento de uma cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos subjacentes e o papel da microbiota durante o CDI ajudarão a levar a novos desenvolvimentos terapêuticos e avanços, possibilitando um melhor controle desta epidemia.
Vários modelos animais, como o hamster e o rato, foram desenvolvidos para fornecer uma visão da defesa imunológica contra C. difficile7,8. No entanto, o papel das células imunes inatas ainda é mal compreendido, particularmente porque o comportamento inato das células imunes é derivado principalmente da análise histológica ou células cultivadas in vitro. Portanto, estabelecer um modelo transparente de zebrafish para revelar a resposta imune inata a C. difficile dentro de um organismo de vertebrado vivo facilitará tais estudos. As larvas de zebrafish têm um sistema imunológico inata funcional, mas não têm o sistema imunológico adaptativo até 4-6 semanas após a fertilização9. Essa característica única faz das larvas de zebrafish um excelente modelo para estudar a resposta isolada e a função das células imunes inatas no CDI.
Este relatório descreve novos métodos usando larvas de zebrafish para estudar as interações entre C. difficile e células imunes inatas, como macrófagos e neutrófilos. Primeiro, um protocolo de microinjeção localizado que inclui c. difficile inoculum e coloração é apresentado. Usando imagens de lapso de tempo confocal in vivo, a resposta de neutrófilos e macrófagos em relação ao local da infecção é registrada, e observa-se a fagocitose de bactérias por neutrófilos e macrófagos. No entanto, foi relatado que a injeção em si causa danos teciduais e leva ao recrutamento de leucócitos independentes das bactérias10. Portanto, um protocolo microgavage não invasivo para entregar C. difficile no intestino de larvas de zebrafish é posteriormente descrito. Estudos anteriores demonstraram que a microbiota gastrointestinal indígena protege um hospedeiro contra a colonização de C. difficile11. Portanto, larvas de zebrafish gnotobióticos também são usadas para predispor os zebrafish que estão infectados 12. Posteriormente, a dissecção intestinal é realizada para recuperar o difundido c. viável e validar a duração de sua presença em tratos intestinais de zebrafish.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos apresentados modificam e estendem uma abordagem existente para infectar larvas de zebrafish realizando injeção e microgavage10,14. Também demonstra uma abordagem para estudar patógenos anaeróbicos com larvas de zebrafish22. Além disso, o protocolo facilita a análise das respostas inatas das células imunes inatos no vivo sobre o CDI e após a colonização de C. difficile em zebrafish. O método é reprodutível…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Timo Fritsch por um excelente cuidado animal. Agradecemos aos membros dos laboratórios Köster e Steinert por apoio e discussões úteis. Agradecemos ao Dr. Dandan Han por ler o manuscrito. Reconhecemos com gratidão o financiamento do Estado Federal da Baixa Saxônia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Riferimenti
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