Clostridioides difficile için Larva Zebrabalığı Enfeksiyon Modeli nin Geliştirilmesi
Summary
Burada mikroenjeksiyon ve noninvaziv mikrogavaj ile floresan olarak etiketlenmiş anaerobik C. difficile ile zebra balığı larvaları enfekte etmek için güvenli ve etkili bir yöntemdir.
Abstract
Clostridioides difficile enfeksiyonu (CDI) Amerika Birleşik Devletleri’nde en yaygın sağlık ilişkili gastrointestinal enfeksiyonlardan biri olarak kabul edilir. C. difficile karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı tanımlanmıştır, ancak CDI nötrofiller ve makrofajlar tam rolleri daha az anlaşılmaktadır. Mevcut çalışmada, Danio rerio (zebrabalığı) larvaları in vivo bu doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin davranış ve işbirliği görüntüleme için bir C. difficile enfeksiyon modeli oluşturmak için kullanılır. C. difficileizlemek için, floresan boya kullanılarak bir etiketleme protokolü kurulmuştur. Lokalize enfeksiyon, zebra balığı nın bağırsak sisteminde aktif olarak yetişen ve CDI’deki intestinal epitel hasarı taklit eden C. difficile etiketli mikroenjeksiyon ile elde edilir. Ancak, bu doğrudan enfeksiyon protokolü invaziv ve deneysel sonuçları etkileyebilir mikroskobik yaralar, neden olur. Bu nedenle, daha noninvaziv bir mikrogavage protokolü burada açıklanmıştır. Yöntem açık ağız yoluyla entübasyon yoluyla doğrudan zebrabalığı larvaları bağırsak içine C. difficile hücrelerinin teslim içerir. Bu enfeksiyon yöntemi yakından C. difficiledoğal enfeksiyon rotasını taklit eder.
Introduction
C. difficile bir gram-pozitif, spor oluşturan, anaerobik, ve gastrointestinal sistemde ciddi enfeksiyonların önde gelen nedeni dir toksin üreten bacillus1. CDI tipik belirtileri ishal dahil, karın ağrısı, ve ölümcül psödomembranöz kolit, ve bazen ölüme yol açabilir1,2. Kanıtlar, konak immün yanıtların bu hastalığın hem ilerlemesinde hem de sonuçlarında kritik bir rol oynadığını göstermiştir3. Bağışıklık yanıtına ek olarak, yerli bağırsak mikrobiyota başlangıcı ve CDI patogenezi için çok önemlidir4. Son on yılda, c. difficile (BI/NAP1/027)5,6hipervirulent suşu ortaya çıkması nedeniyle olgu ların sayısı ve CDI mortalite oranı önemli ölçüde artmıştır. Altta yatan bağışıklık mekanizmaları ve CDI sırasında mikrobiyota rolünün daha iyi anlaşılması yeni terapötik gelişmelere ve gelişmelere yol açacaktır, Bu salgının daha iyi kontrol sağlayan.
Hamster ve fare gibi çeşitli hayvan modelleri, C. difficilekarşıbağışıklık savunma içine fikir sağlamak için geliştirilmiştir7 ,8. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin rolü hala kötü anlaşılmaktadır, özellikle doğuştan gelen bağışıklık hücresi davranışı ağırlıklı olarak histolojik analiz veya in vitro kültürlü hücrelerden türetilmiştir beri. Bu nedenle, canlı bir omurgalı organizmanın içinde C. difficile doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ortaya çıkarmak için şeffaf bir zebrabalığı modeli kurulması bu tür çalışmaları kolaylaştıracaktır. Zebra balığı larvaları fonksiyonel doğuştan gelen bağışıklık sistemine sahiptir, ancak döllenmeden 4-6 hafta sonraya kadar adaptif bağışıklık sistemiyoktur. Bu benzersiz özellik zebra balığı larvaları CDI izole yanıt ve doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model yapar.
Bu rapor, makrofajlar ve nötrofiller gibi C. difficile ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için zebra balığı larvaları kullanarak yeni yöntemler açıklamaktadır. İlk olarak, C. difficile inokül ve boyama içeren lokalize bir mikroenjeksiyon protokolü sunulmuştur. İn vivo konfokal zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak nötrofillerin ve makrofajların enfeksiyon bölgesine tepkisi kaydedilir ve nötrofiller ve makrofajlar tarafından bakterilerin fagositozisi gözlenir. Ancak, enjeksiyon kendisi doku hasarına neden olduğu bildirilmiştir ve bakteri bağımsız lökosit işe yol açar10. Bu nedenle, zebrabalığı larvalarının bağırsağı içine C. difficile teslim etmek için noninvaziv bir mikrogavaj protokolü daha sonra açıklanmıştır. Önceki çalışmalar yerli gastrointestinal mikrobiyota C. difficile11kolonizasyonuna karşı bir konak korumak göstermiştir. Bu nedenle, gnotobiyotik zebra balığı larvaları da enfekte zebra balığı yatkınlık için kullanılır 12. Daha sonra, bağırsak diseksiyonu uygun C. difficile kurtarmak ve zebrabalığı bağırsak larında varlığının süresini doğrulamak için yapılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sunulan yöntemler değiştirmek ve hem enjeksiyon ve mikrogavage 10 ,14gerçekleştirerek zebra balığı larvaları enfekte mevcut bir yaklaşım genişletmek. Ayrıca zebrabalığı larvaları22ile anaerobik patojenleri incelemek için bir yaklaşım göstermektedir. Buna ek olarak, protokol CDI üzerine in vivo doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarının analizini kolaylaştırır ve zebra balıklarında C. difficile<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz mükemmel hayvan bakımı için Timo Fritsch için müteşekkiriz. Köster ve Steinert laboratuvarları üyelerine destek ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Dr. Dandan Han’a el yazını eleştirel okuduğu için teşekkür ederiz. Biz minnetle Aşağı Saksonya Federal Devlet, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) tarafından fon kabul ediyoruz.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Riferimenti
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
