क्लोस्ट्रीडिओइड्स डिफिसिल के लिए लार्वा जेब्राफिश संक्रमण मॉडल का विकास
Summary
यहां प्रस्तुत माइक्रोइंजेक्शन और नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज द्वारा फ्लोरोसेंटी लेबल एनोरोबिक सी डिफिसिल के साथ जेब्राफिश लार्वा को संक्रमित करने के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी तरीका है।
Abstract
क्लोस्ट्रिडियोइड्स डिफिसिल इंफेक्शन (सीडीआई) को संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे आम स्वास्थ्य देखभाल से जुड़े गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल संक्रमणों में से एक माना जाता है। सी डिफिसिल के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का वर्णन किया गया है, लेकिन सीडीआई में न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की सटीक भूमिकाओं को कम समझा जाता है। वर्तमान अध्ययन में, दानियो रेरियो (जेब्राफिश) लार्वा का उपयोग वीवो में इन जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के व्यवहार और सहयोग को इमेजिंग करने के लिए सी डिफिसिल संक्रमण मॉडल स्थापित करने के लिए किया जाता है। सी डिफिसिलकी निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट डाये का इस्तेमाल करते हुए एक लेबलिंग प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है । एक स्थानीयकृत संक्रमण माइक्रोइंजेक्टिंग लेबल सी डिफिसिल द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो सक्रिय रूप से जेब्राफिश आंतों के पथ में बढ़ता है और सीडीआई में आंतों के एपिथेलियल क्षति की नकल करता है। हालांकि, यह सीधा संक्रमण प्रोटोकॉल आक्रामक है और सूक्ष्म घावों का कारण बनता है, जो प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, यहां एक अधिक नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज प्रोटोकॉल वर्णित है। विधि खुले मुंह के माध्यम से इंटुबशन द्वारा सीधे जेब्राफिश लार्वा की आंत में सी डिफिसिल कोशिकाओं की डिलीवरी शामिल है। यह संक्रमण विधि सी डिफिसिलके प्राकृतिक संक्रमण मार्ग की बारीकी से नकल करती है।
Introduction
सी डिफिसिल एक ग्राम-सकारात्मक, बीजाणु बनाने वाला, एनारोबिक और टॉक्सिन-उत्पादक बैसिलस है जो गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट1में गंभीर संक्रमण का प्रमुख कारण है। सीडीआई के विशिष्ट लक्षणों में दस्त, पेट दर्द और घातक छद्म कोलाइटिस शामिल है, और यह कभी-कभी1,2मौत का कारण बन सकता है। साक्ष्य ों से पता चला है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं इस बीमारी की प्रगति और परिणामदोनोंमें महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अलावा, स्वदेशी आंत माइक्रोबायोटा सीडीआई4की शुरुआत और रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण है। पिछले एक दशक में, सी डिफिसिल (बीआई/एनएपी1/027)5,6के अतिविवर्तक तनाव के उद्भव के कारण मामलों की संख्या और सीडीआई की मृत्यु दर दोनों में काफी वृद्धि हुई है । अंतर्निहित प्रतिरक्षा तंत्र की बेहतर समझ और सीडीआई के दौरान माइक्रोबायोटा की भूमिका से नए चिकित्सीय विकास और प्रगति को बढ़ाने में मदद मिलेगी, जिससे इस महामारी का बेहतर नियंत्रण हो सकेगा ।
सी डिफिसिल7,8के खिलाफ प्रतिरक्षा रक्षा में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए हम्सटर और माउस जैसे कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं। हालांकि, जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिका अभी भी खराब समझ में आती है, विशेष रूप से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका व्यवहार मुख्य रूप से विट्रो में हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या सुसंस्कृत कोशिकाओं से प्राप्त होता है। इसलिए, एक जीवित कशेरुकी जीव के अंदर सी डिफिसिल के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रकट करने के लिए एक पारदर्शी ज़ेब्राफिश मॉडल की स्थापना से इस तरह के अध्ययनों की सुविधा होगी। जेब्राफ़िश लार्वा में एक कार्यात्मक सहज प्रतिरक्षा प्रणाली होती है, लेकिन निषेचन9के 4-6 सप्ताह बाद तक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है। यह अनूठी विशेषता जेब्राफिश लार्वा को सीडीआई में जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अलग प्रतिक्रिया और कार्य का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाती है।
इस रिपोर्ट में सी डिफिसिल और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं, जैसे मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश लार्वा का उपयोग करने वाले नए तरीकों का वर्णन किया गया है । सबसे पहले, एक स्थानीयकृत माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल जिसमें सी डिफिसिल इनोकुलम और धुंधला शामिल है प्रस्तुत किया जाता है। वीवो कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग में उपयोग करना, संक्रमण स्थल के प्रति न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज की प्रतिक्रिया दर्ज की जाती है, और न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज द्वारा बैक्टीरिया के फेगोसाइटोसिस को देखा जाता है। हालांकि, यह बताया गया है कि इंजेक्शन स्वयं ऊतक क्षति का कारण बनता है और बैक्टीरिया10से स्वतंत्र ल्यूकोसाइट्स की भर्ती की ओर जाता है। इसलिए, जेब्राफिश लार्वा की आंत में सी डिफिसिल देने के लिए एक नॉनइनवेसिव माइक्रोगेवेज प्रोटोकॉल बाद में वर्णित किया गया है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि स्वदेशी गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल माइक्रोबायोटा सी डिफिसिल11के उपनिवेशीकरण के खिलाफ एक मेजबान की रक्षा करते हैं। इसलिए, गैंटोबायोटिक जेब्राफिश लार्वा का उपयोग जेब्राफिश को संवेदनशील बनाने के लिए भी किया जाता है जो संक्रमित 12हैं। बाद में, आंतों के विच्छेदन व्यवहार्य सी डिफिसिल को ठीक करने और जेब्राफिश आंतों के इलाकों में उनकी उपस्थिति की अवधि को मान्य करने के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रस्तुत किए गए तरीकों में इंजेक्शन और माइक्रोगावेज10,14दोनों का प्रदर्शन करके जेब्राफिश लार्वा को संक्रमित करने के लिए मौजूदा दृष्टिकोण को संशोधित और विस्तारित किया जाता है । य?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उत्कृष्ट पशु देखभाल के लिए टिमो फ्रिट्सच के आभारी हैं। हम समर्थन और उपयोगी चर्चा के लिए कोस्टर और Steinert प्रयोगशालाओं के सदस्यों का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि को महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए हम डॉ ददन हान को धन्यवाद देते हैं । हम कृतज्ञता से लोअर सैक्सनी, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889) के संघीय राज्य द्वारा धन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Riferimenti
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
