Dit protocol beschrijft klinisch implementeerbare bereiding van hoogwaardige PBMC- en plasmabioamples op de klinische proeflocatie die kunnen worden gebruikt voor translationele biomarkeranalyse.
Analyse van biomarkers in perifeer bloed wordt steeds belangrijker in klinische studies om bewijs van mechanisme vast te stellen om effecten van de behandeling te evalueren, en om de dosis en schema-instelling van therapieën te helpen begeleiden. Van een enkele bloedafname kunnen perifere bloedmononucleaire cellen worden geïsoleerd en verwerkt om eiwitmarkers te analyseren en te kwantificeren, en plasmamonsters kunnen worden gebruikt voor de analyse van circulerend tumor-DNA, cytokinen en plasmametabolomics. Longitudinale monsters van een behandeling geven informatie over de evolutie van een bepaalde eiwitmarker, de mutatiestatus en het immunologische landschap van de patiënt. Dit kan alleen worden bereikt als de verwerking van het perifere bloed effectief wordt uitgevoerd op klinische locaties en monsters goed worden bewaard van het bed tot de bank. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor algemeen gebruik dat op klinische locaties kan worden geïmplementeerd voor het verkrijgen van PBMC-pellets en plasmamonsters in multicenter klinische proeven, waarmee klinische professionals in ziekenhuislaboratoria met succes monsters van hoge kwaliteit kunnen leveren, ongeacht hun niveau van technische expertise. Er worden ook alternatieve protocolvariaties gepresenteerd die zijn geoptimaliseerd voor meer specifieke downstream-analysemethoden. We passen dit protocol toe voor het bestuderen van eiwitbiomarkers tegen DNA-schaderespons (DDR) op röntgenstralingsbloed om de geschiktheid van de aanpak aan te tonen in oncologische omgevingen waar DDR-geneesmiddelen en/of radiotherapie zijn beoefend, evenals in preklinische stadia waar mechanistische hypothesetests vereist zijn.
De ontwikkeling van geneesmiddelen is gericht op het leveren van nieuwe therapieën die tegemoet komen aan onvervulde medische behoeften en meer gerichte, gepersonaliseerde geneeskunde. Meerdere geneesmiddelmechanismen worden actief onderzocht, waaronder enzymatische remming zoals kinase1,protease2of poly (ADP-ribose) polymeraseremmers (PARP)3,eiwitafleiders4,therapeutische antilichamen5en antilichaamconjugeerde geneesmiddelen (ADC’s)6, onder vele anderen. Een voorbeeld van de inspanningen om betere behandelingen in de oncologie te verkrijgen , is het gebruik van kinaseremmers met als doel de signaalcascades te stoppen die de proliferatie van kankercellen1,7houden . Het meten van de niveaus van substraatfosforylatie die specifiek zijn voor deze kinases is de beste farmacodynamische biomarker om het werkingsmechanisme van deze remmers te kwantificeren8. Andere geneesmiddelen kunnen de expressie van een bepaald eiwit moduleren en in dat geval is het van het grootste belang om de veranderingen in de concentratie van hun doeleiwit in de lengterichting tijdens de behandeling te kwantificeren. Daarom is, onafhankelijk van de kenmerken van een geneesmiddel of een pathologie, evaluatie van biomarkers om de farmacokinetiek (PK)/farmacodynamica (PD) relatie tussen blootstelling aan geneesmiddelen en doelmodulatie vast te stellen, de beste praktijk in vroege klinische ontwikkeling en maakt het mogelijk een veilige en getolereerde farmacologisch actieve dosis/schema te bepalen9.
Hoewel in de klinische ontwikkeling van oncologie biomarkeranalyse in biopten misschien de beste instelling is om het bewijs van het mechanisme van een geneesmiddel vast te stellen, is het aantal beschikbare biopsieën in een studie meestal vrij beperkt10,11. Als alternatief zijn perifere bloedmonsters zeer waardevol voor klinische proeven omdat ze een minimaal invasieve procedure omvatten, snel en gemakkelijk te verkrijgen zijn voor een vergemakkelijkende longitudinale analyse, goedkoper zijn dan biopten en uitgebreide informatie bieden voor realtime monitoring van het resultaat van een behandeling. Een bijkomend voordeel van de beoordeling van PD-biomarkers in perifeer bloed is het vermogen om de biosample te gebruiken om ook PK te kwantificeren, waardoor nauwkeurigheid mogelijk is bij het bepalen van pk/PD-kwantitatieve relaties en daaropvolgende PK/PD-modellering12,13. Perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC’s) uit volbloed kunnen worden geïsoleerd om eiwitmarkers te bestuderen, die ofwel veranderingen in hun expressieniveau of in hun post-translationele modificaties ervaren. Bovendien kunnen PBMC’s worden gebruikt voor immunofenotyperingsdoeleinden14,15, immuunfunctionaliteitstesten zoals het beoordelen van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC)16 en epigenetische analyse door RNA-isolatie. Evenzo kan plasma uit volbloed worden gebruikt om cytokinen te kwantificeren om de immunologische respons van een patiënt te karakteriseren, om metabolische studies uit te voeren, en ook om circulerend tumor-DNA (ctDNA) te isoleren en te sequencen voor het monitoren van de klonale evolutie van ziekte onder selectie uit het therapeutische middel, vaak met een mechanistische basis voor behandelingsresistentie17,18,19 waardoor de ontwikkeling van volgende generaties therapeutische stoffen mogelijk wordt20. Ten slotte maakt isolatie van circulerende tumorcellen (CTC’s) uit perifeer bloed de evaluatie van ziekteprogressie mogelijk door longitudinale opsomming, DNA/RNA-sequencing en eiwit-biomarkeranalyse21. Hoewel deze isolatie verenigbaar is met het hierin beschreven protocol22, maakt de lage overvloed aan CTC ‘s in veel kankertypen en vroege stadia van de ziekte het gebruik van gespecialiseerde buizen geschikter voor het minimaliseren van CTC-afbraak23.
In de afgelopen jaren heeft het gebruik van vloeibare biopten de informatie die is verkregen in klinische studies verbeterd en PBMC-collecties zijn opgenomen in veel studies om doelbetrokkenheid en bewijs van mechanisme te controleren, hetzij rechtstreeks in tumorcellen voor sommige soorten hematologische maligniteiten, hetzij op de PBMC’s zelf als PD-surrogaten van tumorcellen24,25,26. De bereiding van hoogwaardige monsters heeft een positieve invloed op het bepalen van de veiligste en meest effectieve behandeling voor een bepaalde pathologie, maar onze ervaring is dat de kwaliteit van PBMC-preparaten die zijn verkregen van verschillende klinische locaties is onderworpen aan een grote variabiliteit in kwaliteit, wat resulteert in monsters die niet geschikt zijn voor downstream-analyse. Dit heeft invloed gehad op de hoeveelheid PD-gegevens die uit die studies kunnen worden verzameld.
Hier beschrijven we in detail een eenvoudig te volgen protocol dat laat zien hoe u zowel PBMC’s als plasmamonsters efficiënt kunt isoleren van een enkele bloedafname in een klinische omgeving. Het protocol is gebaseerd op de instructies van de fabrikant van de mononucleaire celvoorbereidingsbuizen, waarin wijzigingen zijn opgenomen waarbij de praktijkervaring problemen in de uitvoering van het protocol heeft aangetoond, zoals gemeld door klinische locaties, zoals centrifugeerproblemen, verwerkingsvertragingen en monsteroverdracht naar cryovials. Er zijn alternatieve commercieel beschikbare methoden voor het gebruik van mononucleaire celpreparaatbuizen op basis van dichtheidsgradiëntscheiding met behulp van polysacharideoplossingen met of zonder barrière die de oplossing van het bloed scheidt27. Als de relevante klinische site al goed ervaren is in deze alternatieve methodologieën, kan dit protocol aanvaardbaar worden vervangen door deze. In dergelijke gevallen kunnen twee factoren worden overwogen: sommige alternatieve methoden vereisen een overdracht van volbloed van een verzamelbuis naar een afzonderlijke bereidingsbuis waar een extra overdracht van menselijk primair biologisch materiaal een licht verhoogd veiligheidsrisico kan opleveren, en het succes van methoden zonder barrières die het bloed van de polysacharideoplossing scheiden, is afhankelijk van kritieke stappen, zoals het laagje van het bloedmonster op het dichtheidsgradiëntmedium dat de ontwikkeling vereist van een verfijnd niveau van technische expertise dat niet altijd in een ziekenhuislaboratoriumomgeving wordt aangetroffen. De bovenstaande punten niettegenstaande, zijn de algehele levensvatbaarheid en het celherstel vergelijkbaar tussen deze technieken15,28. De keuze van de methodologie is daarom enigszins afhankelijk van eerdere technische ervaring, maar in onze handen kunnen mononucleaire celvoorbereidingsbuizen met succes worden gebruikt in een brede klinische context en zijn onze, anders, aanbeveling.
Hoewel een eindpunt van dit protocol is om PBMC-pellets te produceren voor verdere verwerking tot lysaten, kunnen andere definitieve toepassingen van de PBMC-collectie worden geïmplementeerd, zoals isolatie van nucleïnezuren, of het produceren van PBMC-uitstrijkjes of PBMC-blokken die geschikt zijn voor immunohistochmiemethoden (IHC). Belangrijk is dat, aangezien elke biosample van patiënten een invasieve procedure op ten minste een bepaald niveau vertegenwoordigt, dit protocol het nuttige materiaal van elk monster maximaliseert door ook plasma te isoleren dat kan worden gebruikt voor cytokine-analyses, metabolomische studies of ctDNA-sequencing.
De analyse van perifere biomarkers in oncologische studies is een van de vele toepassingen van PBMC-lysaten. Een voorbeeld is de evaluatie van de DNA-schaderespons (DDR) bij behandelingen zoals chemotherapie, radiotherapie of het gebruik van remmers van enzymen die betrokken zijn bij de DDR, zoals de fosfatidylinositol-3 kinase-gerelateerde kinases (PIKK’s)7 en PARPs3,13. Het doel van deze behandelingen is om dna-schade in proliferatiecellen te vergroten, wat een hoge toxiciteit genereert in cellen met verminderde DDR-mechanismen en celcycluscontrolepunten, zoals kankercellen. Hier presenteren we een voorbeeld met een studie van DDR-biomarkers in perifeer bloed dat wordt onderworpen aan röntgenfoto’s.
Hoogwaardige preparaten van PBMC’s en plasma die robuust en reproduceerbaar kunnen worden bereid op klinische proeflocaties zijn van onschatbare waarde om perifere voorspellende en farmacodynamische translationele biomarker-eindpunten van klinische studies te informeren. Hier hebben we een kort, duidelijk protocol verstrekt dat de typisch problematische stappen aanpakt die tot nu toe kwetsbaar zijn geweest voor uitvoeringsfouten in een klinische proefomgeving. Het protocol kan echter verder worden geoptimaliseerd om aan specifieke vereisten te voldoen, zoals tijdsdruk op de klinische locatie of type downstreamanalyses (zie Aanvullend dossier).
Hiertoe hebben we laten zien hoe we zowel PBMC’s als plasma uit volbloed kunnen isoleren met behulp van mononucleaire celvoorbereidingsbuizen om bevroren PBMC-pellets en bevroren plasma te produceren die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan downstreamanalyses. We hebben de aandacht gevestigd op bijzonder kritische protocolstappen met betrekking tot centrifugeren en identificatie van de PBMC-laag in stap 2.5 en PBMC-pellets in stap 3.3 en 3.6. Historisch gezien, waar klinische locaties vaak verkeerd zijn gegaan, is het instellen van de centrifuge op de juiste eenheden (het verwarren van een RCF- of x g-waarde met een RPM-waarde), het vertragen van de verwerking van bloedmonsters, de temperatuur en de aanwezigheid van grote hoeveelheden PBS boven de bevroren celkorrel. In de meeste centrifugerotors zal het ten onrechte invoeren van een x g-waarde als rpm-instelling resulteren in een aanzienlijke ondercentrifugatie met een resulterende slecht gedefinieerde of afwezige PBMC-laag, en mogelijk onbedoelde PBMC-verwijdering tijdens wasstappen als gevolg van inefficiënte celpellets. Er is echter een mogelijkheid dat een PBMC-laag niet zichtbaar is, ondanks het gebruik van de juiste centrifugeerinstellingen en rotoradapter als de patiënt leukopenie heeft ontwikkeld. Deze aandoening kan van invloed zijn op patiënten die zijn ingeschreven voor oncologische onderzoeken als gevolg van chemotherapie of bestralingstherapie en moet worden overwogen. Een ander kritiek punt dat in het protocol duidelijk is gemaakt, is dat monsters binnen 1-2 uur na de bloedafname moeten worden verwerkt om de kans op hemolyse die het protocol negatief beïnvloedt, te verminderen. Bovendien vermindert het streven om de monsters tijdens het eerste uur van de bloedafname te verwerken de ex vivo variabiliteit, wat een grote impact kan hebben op uitlezingen van farmacokinetiek en op biomarkers die worden beïnvloed door bloedconservering of actieve signaleringsroutes, zoals het geval in figuur 4. Vertragingen in de monsterverwerking kunnen ook een nadelig effect hebben op de levensvatbaarheid van cellen als cellen cryopreserved34zullen zijn. Een andere factor die zowel de opbrengst als de verontreiniging van rode bloedcellen kan beïnvloeden, is de opslag- en centrifugeertemperatuur, die bij kamertemperatuur (18-25 °C) moet worden bewaard. Lagere temperaturen verhogen de dichtheid van het dichtheidsgradiëntmedium, wat resulteert in een hogere mate van rode bloedcellen en granulocytverontreiniging, omdat deze cellen niet zo goed aggregeren. Aan de andere kant leiden hogere temperaturen ertoe dat PBMC ‘s vastzitten tussen geaggregeerde erytrocyten, waardoor de opbrengst van het preparaat15,27,28wordt verminderd . En ten slotte is het cruciaal dat er niet meer dan 50-100 μL vloeistof aanwezig is met de celkorrel in het cryoviaal, omdat dit een negatieve invloed heeft op de concentratie van eiwitlysaten die worden verkregen bij downstreamverwerking van deze PBMC-preparaten. Een teveel aan vloeistof zal monsters overdileren, wat leidt tot lysaten met een zeer lage eiwitconcentratie die niet geschikt zijn voor biomarkeranalyse. Bovendien zal het behoud van eventuele post-translationele wijzigingen worden aangetast en zal de efficiëntie van de lysis ook sterk worden verminderd.
Mononucleaire celpreparaatbuizen werden gekozen omdat ze de meest eenvoudige manier bieden om zowel PBMC’s als plasma in één bloedafname te isoleren voor klinische proeven met, in onze ervaring, uitstekende reproduceerbaarheid. De bloedverwerking vereist geen hoogopgeleide operators en het gebruik van een enkele buis elimineert de noodzaak om het bloed en de overdracht ervan naar een andere buis te verdunnen, waardoor het risico op gevaar wordt verlaagd; verkort het protocol vanwege het uitvoeren van de centrifugeerstappen met remmen aan; en alle reagentia bevinden zich in de buis, wat de variabiliteit vermindert. Onze ervaring is dat deze voordelen opwegen tegen de hogere kosten van deze buizen in vergelijking met andere klassieke methoden die alleen het gebruik van een dichtheidsgradiëntscheidingsmedium27,28 (£ 410 per 60 eenheden, terwijl lymfoprep medium voor 66 50-ml preparaten £ 215 is). Ze zijn verkrijgbaar in twee soorten anticoagulantia, heparine en citraat, die beide vergelijkbaar zijn bij het handhaven van de functionaliteit van de geïsoleerde PBMC’s35, daarom zal de keuze van het ene antistollingsmiddel boven het andere gebaseerd zijn op mogelijke invloed van heparine of citraat in de downstream biomarkerstudies. Hoewel is aangetoond dat EDTA-buizen de hoogste PBMC-isolatieopbrengst bieden in vergelijking met heparine of citraat13,is het voordeel van het gebruiksgemak van de manipulatie met één buis contrawicht voor deze overweging. Als cytokinen worden geanalyseerd, kunnen anticoagulantia een effect hebben van de in plasma gedetecteerde niveaus, daarom moeten beide anticoagulantia worden getest voordat er een wordt geselecteerd voor de klinische studie36. Als het plasma wordt gebruikt voor metabolomics studies, met behulp van heparine als antistollingsmiddel zou de voorkeurhebben 37. Daarom is het enige punt dat de eindgebruiker of de translationele wetenschapper van klinische proeven overhoudt, of citraat of heparine geschikter zal zijn voor hun doeleinden zodra de kosten zijn beoordeeld.
Hoewel de voordelen van het gebruik van celpreparaatbuizen talrijk zijn in vergelijking met de beperkingen die ze met zich meebrengen (hogere kosten en beschikbaarheid van een beperkt scala aan anticoagulantia), kan de belangrijkste beperking van het gebruik van PBMC’s of plasma om PD-biomarkers te verkrijgen in klinische studies, vooral in de oncologie, geen verband houden met de isolatiemethode. Met uitzondering van hematologische kankers, waarbij de tumor rechtstreeks uit perifeer bloed wordt bemonsterd, zijn plasma en PBMC’s voor andere kankerindicaties surrogaatweefsels die niet noodzakelijkerwijs de primaire tumor nabootsen. Perifeer weefsel mag het genoom en epigenoom niet delen met de primaire tumor, daarom is de perifere analyse van biomarkers afhankelijk van een specifieke tumormutatie voornamelijk beperkt tot ctDNA-analyse (uit plasma) of CTC’s (door latere sortering van de PBMC-laag). Bovendien is het signaleren van cascades die de tumorproliferatie aansturen of bijdragen mogelijk niet zo actief in perifeer bloed. Deze uitdaging kan worden overwonnen door biomarker discovery benaderingen toe te passen die gericht zijn op bloed8 om alternatieve biomarkers te identificeren of ex vivo behandelingen te koppelen aan de isolatie van plasma38 en PBMC preparaten26.
In het huidige protocol kunnen bevroren PBMC-pellets gemakkelijk van de klinische site worden verwerkt om eiwitlysaten te geven die kunnen worden geëvalueerd met westerse blotting- of ELISA-technieken. Er zijn ook alternatieve methoden gepresenteerd om PBMC’s te gebruiken om IHC-methoden mogelijk te maken (Aanvullend dossier). Daarnaast hebben we ook de mogelijkheid beschreven van cryopreserving PBMC’s (zie Aanvullend Dossier) voor immuuncelbewaking, een relevante toepassing in de oncologie, waarbij immuuncontrolepuntremmers en ADC’s steeds vaker worden getest in klinische studies. De beoordeling van immuunfuncties zoals ADCC16 en immunofenotypering zijn toepassingen die compatibel zijn met cryopreserved PBMC’s geïsoleerd uit mononucleaire celpreparaatbuizen15. Er is een voorbehoud over cryopreservatie, omdat het de down-regulatie van bepaalde oppervlakte- en interne markers kan bevorderen en bepaalde celfuncties kan aantasten, maar PBMC cryopreservatie is de enige haalbare manier om deze assays uit te voeren vanwege tijdsdruk bij het verwerken van monsters van meerdere klinische locaties tot de verwerking in externe laboratoria14,15, en deze schadelijke effecten kunnen sterk worden overwonnen door goede ontdooimethoden en rustperioden39.
Concluderend kan in het hier verstrekte protocol een betrouwbare voorbereiding van PBMC’s en plasmamonsters in elke klinische instelling met gemeenschappelijke apparatuur en materialen mogelijk zijn, zodat translationele eindpunten uit perifeer bloed robuust kunnen worden ingeschakeld in wereldwijde klinische proeven.
Ten slotte laten we zien hoe de analyse van PBMC-lysaten de respons op DNA-schadelijke stoffen mechanistisch kan informeren door een dosisafhankelijke post-translationele modificatie van belangrijke DDR-factoren te tonen, die kan worden gebruikt om de klinische ontwikkeling vorm te geven. Toekomstgerichte, toepassing van methoden die kwantitatiever zijn dan westerse blotting (bijv. massaspectrometrie40) en minder inputmateriaal vereisen (zoals capillaire western blotting en ELISA) zou helpen om deze preklinische resultaten te verplaatsen naar een robuustere, systematische evaluatie van PBMC-patiëntmonsters.
The authors have nothing to disclose.
We willen alle leden van Translational Medicine van AstraZeneca Oncology Research and Early Development bedanken voor hun feedback over het protocol, met name Hedley Carr, Tammie Yeh en Nathan Standifer voor advies over plasmavoorbereiding voor ctDNA-analyse, over PBMC-isolatie en PBMC cryopreservatie en immunofenotypering.
1.5 mL cryovial | Nalgene, ThermoFisher | 5000-1020 | To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs |
1.5 mL microcentrifuge tubes | VWR | 525-0990 | This is an example, use your preferred provider |
15 mL conical sterile propylene centrifuge tube | Nunc, ThermoFisher | 339651 | Other brands can be used |
2 mL screw cap tube sterile, with attached cap | ThermoFisher | 3463 | For plasma aliquoting |
20X TBS Buffer | ThermoFisher Scientific | 28358 | Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider |
20X TBS Tween 20 Buffer | ThermoFisher Scientific | 28360 | Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer |
Automated cell counter or haemocytometer | ThermoScientific | AMQAX1000 | We use Countess device and slides but could be other methods. |
Adjustable micropipette allowing 50 µL measurements | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL | BD | 362761, 362753 | There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw |
Cell-freezing box | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | This is an example, use your preferred provider. |
Centrifugation unit converter | LabTools | http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/ | |
DMSO | Sigma-Aldrich, MERK | D2438 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
ECL horseradish peroxidase substrate | ThermoFisher | 34075 | Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems. |
Faxitron MultiFocus X-ray cabinet | Faxitron Bioptics | To irradiate blood. Other models/makers are available | |
Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated | ThermoScientific | 102706 | Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation |
Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-018 | Optional |
Fixed-angle rotor centrifuge | Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics | ||
Gel doc imaging system | SYNGENE | For imaging HRP developed membranes | |
Heat block | To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors | ||
Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge | Thermoscientific | Heraeus Megafuge 40R | This is an example |
Liquid nitrogen/dry ice | To flash-freeze samples | ||
Marvel dried skimmed milk | Premier Foods | This is an example, use your preferred provider | |
Micropipette tips for range 1-200 µL | To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes) | ||
NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells | ThermoFisher Scientific | NP0321BOX | This is an example, cast your own or use your preferred provider |
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | For imaging HRP developed membranes |
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFisher Scientific | NP0009 | This is an example. |
PBS, no calcium, no magnesium | Gibco, ThermoFisher | 14190-144 | This is usually provided in the clinical kit. |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma-Aldrich, MERK | P5726-1ML | Optional for step 3.7 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma-Aldrich, MERK | P0044-1ML | Optional for step 3.7 |
Rabbit anti GAPDH | Cell Signaling Technology | CST 2128 | 1:1000 dilution in 5% milk TBST |
Rabbit anti γH2AX | Cell Signaling Technology | CST 2577, lot 11 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS1981 ATM | Abcam | ab81292 | 1:2000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti pS635 RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 14223 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total ATM | Abcam | ab32420 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
Rabbit anti total RAD50 | Cell Signaling Technology | CST 3427, lot 2 | 1:1000 dilution in 5 % milk TBST |
RIPA buffer | Sigma-Aldrich, MERK | R0278-50ML | For cell lysis. This is an example, use your preferred provider |
Sonicator | Diagenode | B01060010 | Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator. |
Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes | VWR | 414004-030 | This is an example, use your preferred provider |
Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume) | Costar | 4101, 4051 | This is an example, use your preferred provider |
Trypan blue | ThermoScientific | T10282 | This is for the automated cell counter listed above. |
Wet ice | To keep plasma samples and lysates cold |