Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

Visión general de la estrategia para visualizar, cuantificar y mapear las poblaciones celulares de interés en el TMEPara cuantificar las poblaciones celulares de interés (COI) en diferentes compartimentos tisulares (TCs) y para caracterizar su organización espacial, diseñamos un flujo de trabajo que integra técnicas asequibles y fáciles de usar y maximiza la información posicional que se puede obtener de especímenes clínicos preciosos FFPE(Figura 1). En primer lugar, se teñieron secciones de FFPE de tejido entero en serie para la visualización de COI (por ejemplo, células inmunitarias) y TCs (por ejemplo, estroma versus parénquima)(Figura 1,paso 1). El número de secciones consecutivas que deben mancharse debe mantenerse al mínimo que permita la visualización de las células de interés o las características tisulares necesarias para abordar la cuestión de la investigación. Cuanto menor sea el número de secciones seriales, mayor será el parecido de la arquitectura tisular y la concordancia en secciones contiguas. Además, la capacidad de multiplexación se puede ampliar mediante la reutilización de secciones manchadas fluorescentes a través de técnicas de desmontaje y reprobing19. Una vez realizados los pasos de tinción, se utilizó un escáner de diapositivas completo para digitalizar las imágenes. Las imágenes adquiridas a partir de secciones en serie se alinearon y consolidaron en una diapositiva multiplexación virtual de forma automatizada(Figura 1,sección 2). A continuación, se delineó un ROI para el tejido con un protocolo definido por el usuario que identificaba píxeles asociados al tejido (TAP)(Figura 1, paso 3). Posteriormente, el tejido ROI se segmentó en CI definidas como ROI adicionales. (Figura1, paso 4). A continuación, los protocolos definidos por el usuario detectaron y cuantificaron los COI en diferentes CI(figura 1,paso 5). Finalmente, se generaron mapas de calor tisulares de COI basados en sus densidades y sus coordenadas tisulares(Figura 1,paso 6). Figura 1: Representación esquemática de la estrategia para visualizar, cuantificar y mapear células inmunitarias en el TME. (1) Se tiñó secciones de tejido entero en serie para etiquetar COI y TCs. Las secciones de tejido entero manchado se digitalizaron utilizando un escáner de diapositivas completo. (2) Las imágenes adquiridas en secciones en serie se vincularon, alinearon y coregistraron de forma automatizada utilizando un módulo de análisis de Tissuealign. Se generó una imagen compuesta a partir de la alineación de alta precisión de imágenes individuales. (3) Se utilizó un protocolo definido por el usuario para la detección automatizada de píxeles asociados a tejidos (SAP) en la imagen compuesta. (4) El tejido se segmentó en TCs (por ejemplo, estroma y parénquima) definidos como ROIs. (5) Se utilizaron protocolos definidos por el usuario para la detección y cuantificación automatizada de COI en diferentes CI. (6) Se generaron mapas de calor de tejidos de COI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. COI y TCs de imágenesTres secciones seriales de tejido entero FFPE de tumor resecado de un sujeto con carcinoma hepatocelular asociado al VHB se teñieron en una o más rondas de tinción como en la Figura 2A. La sección I se mantuvo con H&E para mostrar la arquitectura del tejido, la morfología celular y para determinar parámetros clínicamente relevantes como el tipo de neoplasia maligna, el grado tumoral y la evaluación general de la infiltración inmunitaria(Figura 2C). En la sección II contigua, se utilizaron dos rondas de mIF para etiquetar células parénquimales hepáticas y no parénquimales(Figura 2A). En la primera ronda, los vasos normales y tumorales se visualizaron utilizando la tinción CD34 de células endoteliales. Además, las células epiteliales (hepatocitos y colangiocitos) se identificaron utilizando citoqueratina 8/18, y las células estelares hepáticas activadas fibrogénicas se identificaron como células de actina muscular alfa suave (AMA+)(Figura 2C). Después de la adquisición de la imagen, las secciones de tejido fueron despojadas y reprobadas con anticuerpos contra macrófagos (CD68) y miofibroblastos (desmin). Para caracterizar mejor el infiltrado inmune tumoral, la sección iii serial adyacente se tiñó usando dos rondas de mIF para los marcadores celulares CD3, CD4, CD8, caja de cabezal de horquilla P3 (FoxP3) y mieloperoxidasa (MPO). En todos los casos, la DAPI se utilizó como contramancha nuclear. Finalmente, la sección III se tiñó con la mancha PSR y se contramancha con verde rápido para visualizar el colágeno fibrilar y segmentar el tejido en estroma y parénquima(Figura 2C). Se utilizó un escáner de diapositivas completo equipado con una lente objetivo 20X para digitalizar secciones manchadas y crear diapositivas virtuales. Se fusionaron seis imágenes de las tres secciones seriales(Figura 2B)y las diapositivas virtuales se analizaron posteriormente utilizando el software VIS de acuerdo con la representación esquemática de la Figura 1. Análisis de imágenesEl análisis de imagen comprendía cinco pasos: 1) alineación de tejidos; 2) detección de tejido; 3) segmentación de tejidos; 4) cuantificación automatizada de los COI; y 5) mapeo de calor tisular. Todos los protocolos para el análisis de imágenes se desarrollaron utilizando el módulo Autor del software de análisis de imágenes y se denominan en el texto como APP. Alineación de tejidosSe cargaron seis diapositivas virtuales de tres secciones seriales, que abarcan 11 marcadores más las manchas de H&E y PSR, en el módulo Tissualign del software de análisis de imágenes. A continuación, las imágenes se vincularon, alinearon y registraron de forma automatizada, generando una imagen compuesta virtual de 11 plex más H&E y PSR, que contiene todas las capas de las imágenes individuales(Figuras 2A–C). La alineación fue precisa en el caso de imágenes procedentes de secciones seriales adyacentes, mostrando las estructuras de tejido correspondientes posicionadas y dispuestas de manera homóloga tras la alineación(Figura 2C y Figura S1A). Además, la alineación fue precisa a nivel de celda individual para las imágenes procedentes de la misma sección(Figura S1B). El tiempo de alineación automática depende del número, tamaño, complejidad y similitud de las imágenes que se van a alinear. La alineación de las seis diapositivas virtuales mencionadas anteriormente tomó 15 minutos en nuestra estación VIS. Figura 2: Manchado de secciones de tejido serial y alineación de la imagen. (A) Resumen de las manchas realizadas en tres secciones seriales para la visualización de COI y TCs. Para las secciones II y III, los tejidos fueron despojados y reprobidos con un segundo cóctel de anticuerpos. (B) Descripción general de seis imágenes de tejido entero individuales antes y después de la alineación del tejido (izquierda y derecha, respectivamente). Barra de escala a 3.500 m. (C) Vista ampliada de imágenes alineadas. Barra de escala a 80 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Detección de tejidosUna vez que las imágenes estaban vinculadas y alineadas, buscamos identificar los TAP(Figura 3A). Para diseñar una APP para la detección automatizada de TAPs (APP 1, Tabla 1), aprovechamos dos propiedades que diferencian los TAP de los píxeles no asociados al tejido. En primer lugar, la señal DAPI (banda azul) está restringida a los núcleos, que se encuentran exclusivamente en el tejido, lo que significa que todos los píxeles DAPI+ son un subconjunto de TAP. En segundo lugar, los TAP tienen una mayor señal de autofluorescencia en las bandas verde y amarilla en comparación con los píxeles no asociados con el tejido. En consecuencia, desarrollamos APP 1 para la detección de tejidos(Tabla 1),que detecta los TAPs basados en la señal de línea de base en estos canales utilizando técnicas de umbral simples. Los umbrales para las bandas azul, verde y amarilla se establecieron de modo que los TPA tuvieran valores de intensidad de fondo por encima de los umbrales, mientras que los píxeles no asociados con el tejido tenían valores por debajo. APP 1 para la detección de tejidos se aplicó a la imagen IIA, que contiene capas en los canales azul, verde y amarillo(Figura 3A). Como salidas de APP 1, se estableció una máscara verde brillante enlaciendo encima de los TAP, y un ROI llamado “Tissue” fue delineado (salida, Figura 3A). Además, el área del tejido se determinó como una variable de salida cuantitativa. Debido a que APP 1 no incorpora los píxeles no asociados con el tejido en el tejido ROI, fueron excluidos del análisis posterior basado en este ROI(Figura 3A). La precisión de app 1 en la identificación de los TAP se muestra en la Figura 3A. Segmentación y delineación de tejidos para las empresas de libre seguridadA continuación, procedimos a definir diferentes compartimentos dentro del tejido ROI mediante la segmentación del tejido en estroma versus parénquima. Usamos la imagen teñida de PSR (IIIC, Figura 2C),donde el estroma se puede definir como el área asociada con la deposición de colágenos fibrilares (banda roja), el parénquima como el área donde los colágenos fibrilares están ausentes, y prevalecen los tintes de contramancha verde rápido (banda verde)(Figura 3B). Creamos APP 2 (Tabla 1) para delimitar digitalmente los TCs Stroma y Parenchyma. Esta APP funciona en el tejido DE ROI predefinido (salida, Figura 3A)y utiliza áreas representativas de estroma y parénquima para entrenar la herramienta Clasificadora integrada en el módulo Análisis de imagen. El clasificador entrenado asigna los píxeles a un estroma o a una etiqueta de parénquima (salmón y verde, respectivamente, Figura 3B). Tras la clasificación de los píxeles, APP 2 ejecutó operaciones morfológicas destinadas a definir los ROIs Stroma y Parenchyma(Figura 3B y Tabla 1). El rendimiento de APP 2 en la clasificación de píxeles y la generación de los RESPECTIVOs ROI se muestra en la Figura 3B. Además, APP 2 cuantifica el área del estroma y el parénquima. Finalmente, aunque la segmentación se realiza usando la sección manchada PSR, las regiones de estroma y parénquima esbozadas se pueden transferir a cualquier imagen alineada con la imagen PSR. Figura 3: Detección/segmentación automatizada de tejidos y generación de ROI respectivos. (A) La imagen IIA se utilizó para identificar los TPA (imagen izquierda, barra de escala a 6.000 m). Se asignó una máscara verde brillante a los TAP utilizando APP 1 (Tabla 1) generando un ROI llamado Tejido (salida 1). Correcto, el retén muestra una vista ampliada que demuestra la precisión de la aplicación 1 en la detección de TAPs. Barra de escala a 350 m. (B) El tejido ROI (salida 1) se segmenta en estroma y parénquima utilizando APP 2. La imagen de la izquierda muestra una vista del tejido ROI segmentado en estroma ROI (salmón) y parénquima de ROI (verde). Barra de escala a 4.500 m. A la derecha, las vistas ampliadas de la inserción de ROI Tissue, la tinción PSR original (imagen IIIC) y el trote y parénquima de ROI. Barra de escala a 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cuantificación automatizada de COIA continuación, procedimos a identificar, localizar y cuantificar los COI en los ROIs Stroma y Parenchyma. Las APLICACIONES 3 a 8(Tabla 1) se crearon para localizar y contar las siguientes COI: células CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, SMA+ y CD34+, respectivamente. APP 3 fue diseñado para localizar y contar células CD4+FoxP3+ (imagen IIIA, Figura 2C)como marcadores suplentes de células T reguladoras (Tregs). Este protocolo detecta la colocación de la señal desde el factor de transcripción nuclear FoxP3 (banda roja) y el colorante de etiquetado de ADN DAPI (banda azul). Dado que las células T activadas recientemente regulan FoxP3, para enriquecer para Tregs establecemos umbrales para preseleccionar solo celdas FoxP3+ brillantes (FoxP3hi). A continuación, de todas las célulasde hi dAPI+FoxP3 preseleccionadas, solo las que estaban rodeadas por señales CD4 en forma de anillo brillante (banda verde) fueron etiquetadas y contadas como células FoxP3hiCD4+ (etiqueta rosa, Figura 4A). La densidad de las células FoxP3hiCD4+ en los ROIs Stroma y Parenchyma se determinó como variables de salida cuantitativas de APP 3(Figura 4A). Del mismo modo, las APPs 4 a 6 fueron diseñadas para la detección de células CD8+, CD68+ y MPO+. Estas API comparten el mismo diseño de línea base para detectar y cuantificar LAS COI. Específicamente, los COI se identifican en función de la intensidad de la señal del biomarcador específico de la población celular y, a continuación, se ejecutan varios pasos morfológicos de postprocesamiento para delinear células individuales (Tabla 1). Las células individuales o COIs se etiquetan, se cuentan y sus coordenadas tisulares se registran. Las APPs 4 a 6 también determinan la densidad de los COI en los ROI Stroma y Parenchyma(Figura 4B–D). La calidad de nuestra tinción DAPI no fue lo suficientemente buena para integrar la segmentación de núcleos en las APPs 3 a 6, por lo que no podemos garantizar que todos los objetos etiquetados individualmente sean células individuales. Por esta razón, expresamos la densidad de celdas en recuentos de objetos etiquetados/mm2 (Figura 4). Sin embargo, los agregados de celdas se separaron con éxito en celdas individuales en los pasos de postprocesamiento integrados en las APLICACIONES 3 a 6, y una inspección visual exhaustiva mostró que la mayoría de los objetos etiquetados correspondían a celdas individuales. Para detectar el área de SMA+ y CD34+, desarrollamos apps 7 y 8, respectivamente(Tabla 1). Ambas APP detectan la señal específica basada en umbrales y determinan el porcentaje de área positiva en los ROI Stroma y Parenchyma(Figura 4E–F). Una de las posibilidades más interesantes de generar diapositivas multiplexvirtuales virtuales es el análisis de la expresión de colocalización. Generamos APP 10 para detectar la colocalización entre la AMA y la desmina, dos marcadores co-expresados por miofibroblastos en el hígado. APP 10 utiliza umbrales para encontrar píxeles positivos para la aME, la desmina y la AIMA más la desmina(Tabla 1). Como variables de salida cuantitativas, APP 10 determina el área de SMA+, el área desmin+ y el área de expresión colocalizada de estos dos marcadores(Figura S3). Figura 4: Identificación y cuantificación de los COI en el estroma y el parénquima. (A–F) Detección y cuantificación automatizadas de los COI CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, SMA+ y CD34+ en los ROI Stroma y Parenchyma utilizando los protocolos 3, 4, 5, 6, 7 y 8, respectivamente (Tabla 1). A la izquierda se muestran las imágenes originales, en el centro las imágenes procesadas y a la derecha las cuantificaciones. Para las figuras 4A–D, barra de escala a 40 m. Para las figuras 4E y F, barra de escala de 350 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Como alternativa a la cuantificación de los COI en los TCs Stroma y Parenchyma, determinamos la densidad de las células inmunitarias en los diferentes nódulos malignos denominados 1 a 4(Figura 5A, He I). El ROI para cada nódulo se delineó manualmente como se indica en la Figura 5A. Las firmas inmunitarias de tejido distintivo caracterizaron cada nódulo, revelando aún más la heterogeneidad intrínseca del TME. Mapas de calor de tejidoComo se mencionó anteriormente, las APPs 3 a 8 almacenan las coordenadas tisulares de cada objeto etiquetado individualmente. Esta característica permite la generación automatizada de mapas de tejido donde las regiones de alta densidad de una población celular determinada se muestran como puntos calientes (rojo) y regiones con densidad relativamente baja como puntos fríos (azul oscuro). A los valores de densidad intermedia se les asignan colores según la escala de color que se muestra en la Figura 5. Los mapas de calor de tejido fueron generados por apps que dividieron las imágenes en círculos de 50 m de diámetro y asignaron un color de acuerdo con la densidad relativa de un COI dado dentro del círculo. Como se muestra en la Figura 5B–G, los patrones de posicionamiento y la distribución de intensidad de los diferentes COI en el TME fueron bastante variados. Además, a nivel de nódulos individuales, la disposición de diferentes poblaciones en el área tisular fue única(Figura S2A–C). Para proporcionar un ejemplo del poder de esta técnica y visualizar la organización espacial de puntos calientes de diferentes poblaciones en el mismo nódulo, los puntos calientes de tipos de celda individuales se extrajeron manualmente y se asignaron juntos en el contorno del nódulo 2(Figura S2, Figura Dy Figura E). Figura 5: Mapas de calor de tejido de COI en el TME. (A) Mancha roja picrosirius que muestra la ubicación de los nódulos 1, 2, 3 y 4. (B–G) Mapas de calor de tejido para LOS COI CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, CD34+ y .SMA+, respectivamente. El azul oscuro indica una densidad relativamente baja, y el rojo indica una densidad relativamente alta. A los valores de densidad intermedios se les asignan colores según la escala de colormostrada. (H e I) Cuantificación de COI en nódulos 1, 2 y 3 + 4 organizados por tipo de celda y por nódulo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria S1: Validación de la alineación de tejidos. (A) La tinción CD34 (en rojo) realizada en la sección II (entrada 1) se utiliza para generar una máscara CD34 en verde (salida 1). La máscara verde (salida 1) se superpone en la imagen de H&E de la sección serial alineada I (entrada 2). La imagen de fusión muestra una correspondencia perfecta de las estructuras vasculares. Barra de escala a 50 m. (B) La imagen IIIA que muestra la fusión de DAPI, CD4 y FoxP3 (entrada 1) se utilizó para generar una etiqueta para las celdas CD4+FoxP3+ (salida 1 en magenta). La etiqueta de salida 1 se transfirió a la imagen alineada IIIB (entrada 2) y muestra la correspondencia perfecta entre los pares FoxP3/DAPI y CD4/CD3 en la imagen de fusión. Barra de escala a 15 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria S2: Vista ampliada de los mapas de calor de tejido. (A–C) Mapas de calor de tejido para células CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+ y MPO+ en nódulos 1–4. Las barras de escala en los nódulos 1, 2 y 3 + 4 representan 1.500 m, 700 m y 500 m respectivamente. (D) Esquema del nódulo 2 con línea sólida negra. (E) Los puntos calientes para las celdas CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+ y MPO+ en el nódulo 2 se extrajeron y asignaron juntos en el contorno del nódulo 2 definido en D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura suplementaria S3: Análisis de colocación. (A) A la izquierda y al centro hay imágenes de la etiqueta de la ameta en verde y la etiqueta de desmin en rojo respectivamente. A la derecha se encuentra un área doble positiva de la AMA/desmina en amarillo. (B) Cuantificación del área de la AMA+, el área de desmin +y el área doble positiva de la AMA/desmina. Barra de escala a 150 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Aplicación Propósito Clasificación Clasificación Pasos posteriores al procesamiento Variables de salida Método Funciones (valor de píxel) 1 Detección de tejidos Umbral Canal DAPI (150) o Etiquetar objetos con valores colocalizados por encima del umbral para los 3 canales o Roi Tissue Canal FITC/A488 (120) o Cerrar objeto positivo 5 píxeles o Zona de tejidos Canal TRITC/A568 (40) o Crear tejido ROI 2 Segmentación de tejidos Bosque de decisión Mediana RGB-R o Rellenar agujeros o ROI Stroma Mediana RGB-G o Crear ROI Stroma o Stroma Area Mediana RGB-B o Crear ROI Parenchyma o ROI Parenchyma Mediana de IHS-S o Zona de Parenchyma H&E Eosin mediana 3 Para localizar y cuantificar células CD4+ FoxP3+ Umbral DAPI de canal (>600) o Etiquetar objetos con colocalización de DAPI y Cy5/A647, rodeados de señal FITC/A488 o Recuentos y densidad de células CD4+FoxP3+ en ROIs Stroma y Parenchyma Suavizado de polisuavizado DE canal FITC/A488 (>850) o Borrar objetos de menos de 7 m2 o Coordenadas de células INDIVIDUALes CD4+FoxP3+ Canal Cy5/A647(>800) 4 Para localizar y cuantificar células CD8+ Umbral DAPI de canal (<1200) o Borrar objetos positivos de menos de 15 m2 o Recuentos y densidad de células CD8+ en ROIs Stroma y Parenchyma Mediana del canal Cy5/A647 (>80) o Cerrar objetos positivos 2 píxeles o Coordenadas de células individuales o Objetos separados 5 Para localizar y cuantificar células CD68+ Umbral Canal FITC/A488 (>200) o Borrar objetos positivos de menos de 20 m2 o Recuentos y densidad de células CD68+ en ROIs Stroma y Parenchyma o Dilatar objetos positivos 3 píxeles o Coordenadas de células CD68+ individuales o Objetos separados 6 Para localizar y cuantificar células MPO+ Umbral DAPI de canal (>400) o Borrar objetos de menos de 5m2 o Recuentos y densidad de células MPO+ en ROIs Stroma y Parenchyma. Canal TRITC/A568 (900-4000) o Dilatar objetos positivos de 3 píxeles o Coordenadas de células MPO+ individuales. o Objetos separados 7 Para localizar y cuantificar el área de sMA+ Umbral Canal TRITC/CF568 (>1050) o Borrar objetos positivos de menos de 25 m2 o Recuentos y densidad del área de sMA+ en los ROIs Stroma y Parenchyma o Dilatar objetos positivos de 3 píxeles o Coordenadas de píxeles de la SMA+ 8 Localizar y cuantificar el área DE CD34+ Umbral DAPI de canal (<5000) o Borrar objetos positivos de menos de 25 m2 o Recuentos y densidad del área CD34+ en ROIs Stroma y Parenchyma Mediana del canal Cy5/A647 (>120) o Dilatar objetos positivos de 3 píxeles o Coordenadas de los píxeles CD34+ 9 Crear mapas de calor de tejido para una población celular determinada Mapa de calor de objetos Mapa de calor de objetos o Mapa de calor Radio de dibujo 50 m — 10 Cuantificar la colocalización entre el SMA y el Desmin Umbral Canal TRITC (CF568) (>1050) o Etiquetar objetos con valores de umbral superiores para TRITC (CF568) o Cuantificar la expresión colocalizada de la AMA y desmin Canal Cy5 (A647) (>1000) o Etiquetar objetos con valores de umbral superiores para Cy5 (A647) o Etiquetar objetos con colocación de valores de umbral superiores para TRITC (CF568) y Cy5 (A647) o Borrar objetos positivos de menos de 25 m2 Tabla 1: Parámetros generales utilizados para el diseño de APPs empleadas para el análisis de imágenes. Los parámetros especificados en esta tabla se ajustan a las características únicas de las imágenes utilizadas en este análisis (por ejemplo, fondo, artefactos, etc.) y pueden no ser aplicables a otras imágenes. Debido a que los pasos de postprocesamiento mencionados se definieron para las imágenes específicas analizadas en este estudio, no se detallan intencionalmente. El usuario debe personalizar las APLICACIONES a las imágenes que se analizarán. Sección/Mancha Anticuerpo primario Anticuerpo secundario Sección II/1st Tining Ratón IgG2a anti-humanos -SMARatón IgG1 antihumano CD34Conejo anti-humano Cytoqueatin 8/18 Cabra anti-ratón IgG2a CF568Rata anti-ratón IgG1 A647Burro anticonejo A488 Sección II/2nd Tining Conejo antihumano DesminRatón antihumano CD68 Burro anticonejo A647Donkey anti-ratón DyLight 755 Sección III/1st Tining Ratón antihumano CD4Conejo antihumano FoxP3Cabra anti-humano MPO Donkey anti-ratón A488Burro anticonejo A647Burro anti-cabra A568 SecciónIII/2nd Tining Rabbit anti-humano CD3Ratón antihumano CD8 Donkey anti-ratón DyLight 755Burro anticonejo A647 Tabla 2: Pares de anticuerpos primarios-secundarios para mIF.