Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Todo o trabalho envolvendo animais foi realizado de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Colégio William e Maria. 1. Cuidados com animais e manuseio de embriões Induzir o acasalamento natural administrando uma injeção subcutânea de gonadotropina chorionica humana (HCG) no saco linfático dorsal do adulto Xenopus laevis em uma dose de 600 U para fêmeas e 400 U para machos. Após a injeção, coloque pelo menos um macho e um sapo fêmea em um tanque de espera de temperatura ambiente durante a noite. A colocação de ovos normalmente começa de 9-12 h após a administração do HCG. Coletar embriões. Degeleia lavando suavemente com 2% de cisteína (pH 8.0) por 2-4 min. Enxágüe os embriões 3x em 0,1x A solução modificada do Ringer (MMR) de Mark (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH ajustado para 7,4-7,6). Transfira os embriões para placas de petri de vidro de 100 mm contendo 0,1x MMR e 50 μg/mL gentamicina. Uma densidade de 50-100 embriões por prato é apropriada. Incubar os pratos a 14 °C-22°C e permitir que os embriões se desenvolvam até chegarem ao estágio de desenvolvimento desejado. Remova periodicamente células não fertilizadas e embriões necrosados ou anormalmente em desenvolvimento com uma pipeta de transferência plástica.NOTA: Para garantir a consistência, o desenvolvimento é realizado de acordo com critérios morfológicos definidos por Nieuwkoop e Faber16. As etapas de interesse variarão com base no foco experimental. Por exemplo, os principais marcos neurodesenvolvimentísticos estão associados ao Estágio 14 (início da neurulação), estágio 18 (início do fechamento do tubo neural) e estágio 22 (início de alongamento do botão de cauda). 2. Dissecação de embriões e preparação de amostras Preparação de soluções Prepare 2 mM Ca2+ solução contendo 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mM MgSO4e 4,6 mM Tris. Para cada solução de 100 mL, adicione 1 mL de penicilina/estreptomia (10.000 penicilina U/mL; 10.000 μg/mL estreptomicina). Ajuste o pH para 7,8 e esterilize o filtro. Prepare a solução sem cálcio e magnésio (CMF) combinando 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris e 0,4 mM EDTA. Ajuste o pH para 7,8 e autoclave para esterilizar. Para cada solução de 100 mL, adicione 1 mL de penicilina/estreptomia (10.000 penicilina U/mL; 10.000 μg/mL estreptomicina). Ajuste o pH para 7,8 e esterilize o filtro. Preparação de placas para dissecação e imagem UV-esterilizar dois pratos de Petri de plástico de 35 mm e um Prato de Cultura Celular de 35 mm (ver Tabela de Materiais). Enquanto trabalha em um capô de fluxo laminar, prepare dois tubos cônicos plásticos de 50 mL contendo 10 mL de 2 mM Ca2+ solução cada. Continue trabalhando na capa de fluxo de laminar e adicione 2 mL de 2 mM Ca2+ solução a uma placa de Petri de plástico de 35 mm, 2 mL de 2 mM Ca2+ solução para um Prato de Cultura Celular de 35 mm e 2 mL de solução CMF para uma placa de Petri de plástico de 35 mm. Fora do capô de fluxo laminar, encha duas placas de Petri de 100 mm de plástico e uma placa de Petri de 35 mm de plástico com 0,1x MMR com gentamicina (50 μg/mL). Encha uma placa de Petri de plástico de 60 mm com 70% de etanol. Imediatamente antes da dissecação, adicione 0,01 g de Collagenase B a um dos tubos de 50 mL contendo solução Ca2+. Misture bem e transfira a solução para uma placa de Petri de plástico de 60 mm. Com a ajuda de um microscópio dissecando, identifique embriões do estágio de desenvolvimento desejado. Use uma pipeta de transferência estéril para transferir pelo menos seis embriões apropriados para uma das placas de 100 mm contendo 0,1x MMR + gentamicina preparada na etapa 2.2.4. Isso servirá como a placa de detenção. Use uma pipeta de transferência estéril para transferir um embrião para a segunda placa de 100 mm contendo 0,1x MMR + gentamicina. Isso servirá como placa de dissecção. Se dissecar embriões com idade suficiente para mover (aproximadamente estágio 23 ou mais), anestesiar cada embrião antes da dissecação transferindo-o para um prato contendo 0,1% 3-aminobenzoicácido etil ester diluído em 0,1x MMR com gentamicina (50 μg/mL). Uma vez que o embrião é imobilizado, transfira-o de volta para o prato contendo 0,1x MMR com gentamicina (50 μg/mL) e continue com a dissecação. Remova cuidadosamente a membrana vitellina que circunda o embrião. Isso pode ser feito mais facilmente usando um par de fórceps contundentes para estabilizar o embrião enquanto usa um par de fórceps finos para agarrar a membrana. Puxe cuidadosamente com os fórceps finos para descascar a membrana de vitellina. Use fórceps finos para separar as regiões dorsal e ventral do embrião. Isso pode ser feito usando os fórceps para ‘beliscar’ o embrião ao longo do eixo anterior-posterior, cortando-o ao meio. Com uma pipeta de transferência estéril, transfira a porção dorsal para a placa de 60 mm com solução colagenase preparada na etapa 2.2.5. Descarte a porção ventral. Permita que a explanta dorsal incubar na solução colagenase por 1-2 min à temperatura ambiente. Transfira-o suavemente de volta para a placa de dissecção. Complete a dissecação removendo cuidadosamente toda a contaminação endódrmica e mesodérmica residual do tecido neural presuntivo do ectoderm. Para embriões no Estágio 22 ou mais, o tubo neural também deve ser removido e descartado.NOTA: Se necessário durante a dissecção, o prato de 70% de etanol preparado na etapa 2.2.4 pode ser usado para limpar ou reesterilizar os fórceps. Uma vez que a dissecação esteja completa, transfira suavemente a explanta para a placa de 35 mm de solução Ca2+ preparada na etapa 2.2.3. Repita as etapas 2.4-2.9 até que quatro explantas sejam coletadas. Use uma micropipette P1000 para transferir todas as quatro explantas para a placa de 35 mm contendo solução CMF, tomando cuidado para evitar qualquer contato entre as explantas e a interface ar-água. Gire suavemente o prato para que todas as explants se aglomeram no centro da placa. Incubar 1 h à temperatura ambiente para permitir que explants se dissociam.NOTA: Para auxiliar na dissociação, pode ser adicionada a tentação de 0,02% a 0,01% à solução CMF. Isso pode ser necessário para uma dissociação eficiente de embriões mais antigos (estágio 22 ou mais). Neste ponto, pelo menos dois embriões devidamente encenados devem permanecer na placa de detenção. Transfira esses embriões para um prato fresco recheado com 0,1x MMR com gentamicina preparado na etapa 2.2.4 e permita que eles se desenvolvam sem ser incomodado com o prato coberto para combinar com o prato explant. Esses embriões servirão como controles de irmãos. Use supercola para anexar um deslizamento de cobertura micro-governado (ver Tabela de Materiais) na parte inferior do Prato de Cultura Celular de 35 mm preparado na etapa 2.2.3.NOTA: Coloque pequenos dabs de supercola ao redor das bordas do deslizamento de cobertura, em seguida, pressione-o firmemente contra a parte inferior do Prato de Cultura Celular. As marcas posicionais serão obscurecidas em qualquer lugar que a cola entre em contato com a grade, por isso é importante manter a parte central do deslizamento de cobertura livre de adesivos. Depois que as explantas se dissociaram por 1h, use uma micropipette P100 para transferi-las para o Prato de Cultura Celular. A fim de emplacar o maior número possível de células na porção gridded do prato, segure a pipeta em um ângulo raso perto da superfície do prato, posicione a ponta pipette no canto da grade voltada para dentro, e expulse firmemente a suspensão da célula através do ar gridded ea. Idealmente, as células se estabelecerão em um aglomerado apertado e denso. Incubar por 1h à temperatura ambiente para permitir que as células aderem à placa. Determine e registre o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos quando essa incubação começa. Combine 5 μL 1 mM Fluo-4 AM (ver Tabela de Materiais) com 2 μL de 10% ácido F-127 plurônico.NOTA: Fluo-4 AM é sensível à luz e deve ser mantido em um tubo leve ou coberto de papel alumínio o tempo todo. Depois que a incubação estiver completa, mova o prato de amostra para uma sala escura ou outro local protegido pela luz. Use uma micropipette para remover 100 μL de solução da borda do prato. Adicione esta solução à alíquota do fluo-4 AM/Ácido F-127, pipette para cima e para baixo para misturar, e devolver o volume completo ao prato de amostra. Redemoinho suavemente para misturar. Cubra a placa com papel alumínio e deixe incubar por 1h à temperatura ambiente. Determine e registre o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos quando essa incubação começa. No final da incubação, use o tubo cônico remanescente de 2 mM Ca2+ para realizar três lavantes de mídia da seguinte forma: 1) remova 1 mL de solução do prato, adicione 3 mL de solução fresca, 2) remova 3 mL de solução do prato, adicione 3 mL de solução fresca, 3) remova 3 mL de solução do prato, adicione 3 mL de solução fresca. 3. Imagem de cálcio NOTA: A imagem de cálcio foi realizada utilizando um microscópio confocal invertido (Tabela de Materiais). Coloque a placa de amostra no estágio do microscópio, tomando cuidado para protegê-la da exposição à luz ambiente. Uma vez que a placa esteja presa, use um marcador para rotular o ponto frontal da placa para que o mesmo campo de visão possa ser encontrado em imagens subsequentes. Localize a amostra o microscópio — primeiro em 10X e depois na ampliação de 20X — e selecione um campo de visão apropriado para imagens. Um campo de visão ideal é denso celular, mas não tão denso que as células são agrupadas ou difíceis de distinguir individualmente. Ajuste o foco do microscópio para que o deslizamento de cobertura com tampa da grade seja visível. Os números marcados no deslizamento de cobertura servem como identificadores exclusivos para locus de grade particular e podem ser usados para localizar o mesmo campo de visão para imagens adicionais. Se o campo de visão originalmente selecionado não se sobrepor a nenhum número, reajuste até que um número identificável esteja no quadro. Tire uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com o deslizamento de cobertura governado pela grade em foco. Ajuste as configurações de foco e tire uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com as células em foco. Com a camada celular em foco, ilumine as amostras com um laser de 488 nm. Os valores de HV e Offset podem ser otimizados para cada experimento para garantir que uma gama dinâmica de fluorescência seja detectada no canal FITC. Para uma imagem de duas horas, modifique a configuração de imagem para gravar 901 quadros com um tempo de varredura de 3,93 s e um intervalo de configuração de 8 s. Executar para adquirir imagem. Uma vez que a imagem esteja completa, remova a placa do estágio do microscópio. Remova 1 mL de solução da placa e substitua-a por 1 mL de MEMFA 2x (MOPS de 200 mM, 2 mM EGTA e 2 mM MgSO4 em 7,4% formaldeído). Incubar a placa por 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. Determine e registre o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos quando essa incubação começa. Após a fixação estiver completa, remova toda a solução da placa e substitua-a por 2 mL de 1x PBS. Guarde placas a 4 °C para posterior processamento. 4. Análise de Expressão Genética: Síntese de sondas Como descrito abaixo, gere uma sonda antisense rna para hibridização in situ. Além disso, gerar uma sonda de sentido para o mesmo gene para uso como controle negativo. A fim de purificar o DNA plasmídeo contendo a sequência do modelo de sonda, inocular 150 mL de caldo LB com estoques de glicerol bacteriano contendo o plasmídeo do modelo. Incuba-se a 37 °C com tremor durante a noite ou até que a cultura seja turva. Purificar o DNA plasmídeo da cultura bacteriana usando seu método de escolha.NOTA: Usamos o kit mcnary-nagel midi-prep para obter altos rendimentos de DNA plasmídeo. Para confirmar que o plasmídeo contém a inserção esperada, realize uma restrição de digestão e analise os produtos em um gel de agarose. Plasmídeo sem cortes também pode ser analisado em um gel de agarose para verificar se há contaminação de DNA genômica. Para linearizar o DNA do modelo, configure uma reação de digestão de restrição de 100 μL contendo 20 μg de DNA plasmídeo, 2 μL de enzima de restrição apropriada e 1x tampão apropriado. Incubar a 37 °C por pelo menos 2h. Extrair DNA linearizado realizando uma extração fenol/clorofórmio seguida de uma extração de clorofórmio. Precipitar DNA com 100% de etanol. Isso pode ser feito rapidamente adicionando dois volumes de etanol frio à amostra e incubando-o a -80 °C até que se solidifique (15-30 min). Use uma centrífuga refrigerada para o DNA de pelotas girando por 20 min a 12.000 x g/4 °C. Retire o supernatant e lave a pelota com 200 μL de 70% de etanol. Gire por 5 min a 12.000 x g/4 °C. Remova a pelota supernatant e seca a ar por aproximadamente 5 min. Resuspender em 20 μL de 1x TE e armazene a 4 °C até o uso posterior. Para sintetizar e purificar sonda antisense RNA, crie uma mistura rNTP de 2,5 mM combinando 15 μL de 10 mM rCTP, 15 μL de 10 mM rGTP, 15 μL de 10 mM rATP, 9,75 μL de 10 mM rUTP, e 5,25 μL de 10 m dig-11 UTP (Ver Materiais de Mesa). Configure uma reação de transcrição in vitro de 50 μL contendo 4 μg de DNA linearizado do modelo da etapa 4.2-4.10, 15 μL de mistura rNTP de 2,5 mM a partir da etapa 4.11, 10 μL de buffer de transcrição de 5x, 5 μL de 0,1 M DTT, 0,5 μL de inibidor RNAse (20 U/μL) e 1,5 μL de polimerase RNA apropriada (T3, T7 ou SP6). Incuba1 1 h a 37 °C. Adicione um adicional de 1,5 μL de polímero de RNA à reação e volte a 37 °C por mais uma hora. Adicione 1 μL de RQ1 DNAse à reação e incuba a 37 °C por 10 min para degradar o modelo de DNA. Adicione 30 μL de solução LiCl de 7,5 M para provar. Pipette para misturar e incubar a -20 °C por pelo menos 1h. Usando uma centrífuga refrigerada, gire a amostra de 25 min a 14.000 x g/4 °C. Retire o supernatant e enxágue a pelota com 500 μL de 70% de etanol. Gire por 5 min a 14.000 x g/4 °C. Remova a pelota supernatant e seca a ar por aproximadamente 5 min. Resuspender em 20 μL de água livre de nuca. Crie em 10x o estoque de sondas diluindo a amostra a uma concentração de 10 ng/μL em Buffer de Hibridização (50% de formamide, 5x SSC (citrato salino-sódio; 750 mM NaCl, 75 mM de citrato de sódio, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1 % Tween-20, 1x Denhardt’s Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100 μg/mL heparin). Guarde a -20 °C até mais uso. 5. Análise de Expressão Genética: Fluorescência na Hibridização situ NOTA: Todas as lavas devem ser realizadas com aproximadamente 1 mL de solução usando uma tubulata de transferência estéril e embrulhada individualmente. A pipeta deve ser posicionada na borda da placa ao remover ou adicionar solução, e as lavas devem ser executadas da forma mais suave possível para garantir que as células não sejam desalojadas da superfície da placa e perdidas. Remova 1x PBS da placa (a partir da etapa 3.10). Substitua por 1x PBS fresco e incuba 5 min em temperatura ambiente. Combine 25 mL de trietanolamina de 0,1 M (pH 8.0) com 62,5 μL de anidreto acético. Misture bem. Lave a placa com esta solução por 10 min. Lave a placa com 1x SSC por 5 min. Lave a placa com 0,02 M HCl por 10 min para permeabilizar células. Lave 2x com 1x PBS por 5 min cada. Remova a solução e adicione 1 mL de Buffer de Hibridização (50% de formamide, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM de citrato de sódio, pH 7.0), 1 mg/mL torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x Denhardt’s Solution, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA e 100 μg/mL heparin) para placa. Incubar com tremor por pelo menos 6h a 60 °C. Remova o Buffer de Hibridização e substitua por 750 μL da solução 1x RNA Probe (forma diluída do estoque de 10x feito na etapa 4.19. As sondas de RNA do sentido podem ser usadas como um controle negativo. Incubar com tremor por 8-14 h a 60 °C. Remova a sonda e armazene a -20 °C.NOTA: Diluição de sonda 1x pode ser reutilizada até três vezes antes de ser descartada. Enxágüe a placa com 0,2x SSC. Lave com SSC fresco de 0,2x por 1h a 60 °C. Mova as placas para temperatura ambiente e equilibre por 5 min. Lave a placa com 0,2x SSC por 5 min. Lave a placa com 1x PBT por 15 min. Lave a placa com 2% H2O2 em 1x PBT (0,1% Triton-x-100) por 1 h.NOTA: Esta solução é sensível à luz, por isso deve ser feita fresca para cada experimento e protegida da luz. As placas também devem ser protegidas da luz ou frustradas durante esta incubação. Lave a placa com 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0,1%Tween-20) por 15 min. Diluição de bloqueio de reagente para 2% em Tampão ácido maleico (100 mM ácido maleico, 150 mM NaCl, pH 7,5). Bloqueie as células nesta mistura por pelo menos 1h à temperatura ambiente. Substitua a solução de bloqueio por anticorpo anti-digoxygenin-POD diluído 1:1.000 em 2% de bloqueio de reagente em Tampão ácido maleico. Incubar durante a noite a 4°C. Enxágüe a placa 3x com 1x TBST. Lave 4x com 2mL de 1x TBST por pelo menos 15 min por lavagem com balanço contínuo. Lave 2x com 1x PBT por pelo menos 10 min por lavagem com balanço contínuo. Diluir tyramida conjugado cy3 1:25 em 1x PBT. Lave a placa com 750 μL desta diluição por 5 min.NOTA: Esta solução é extremamente sensível à luz, e as placas devem ser mantidas frustradas ou protegidas da luz para o restante do experimento para evitar a deterioração do sinal. Adicione 2,5 μL de 0,3% H2O2 a esta solução e incuba com balanço contínuo por mais 40 min à temperatura ambiente. Lave 4x com 1x TBST por pelo menos 15 min por lavagem com balanço contínuo. Enxágüe com 1x PBT. Fixar as células incubando por 1h à temperatura ambiente em 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA e 1 mM MgSO4 em 3,7% formaldeído). Remova a solução e substitua por 1x PBS. Guarde as placas em um recipiente frustrado a 4 °C até o processamento posterior. 6. Células de imagem NOTA: A imagem foi realizada usando um microscópio confocal invertido. Coloque a placa de amostra no palco do microscópio, alinhando a marca feita na etapa 3.1 à frente do palco. Concentre a imagem para que o deslizamento de cobertura forrado na grade seja visível e, usando a imagem da grade feita no passo 3.4 como referência, ajuste o campo de visão para combinar com o campo de visão capturado na imagem de cálcio (Seção 3). Adquirir imagens de campo brilhante tanto da grade quanto das células. Ilumine as amostras com um laser TRITC de 595 nm. Ajuste os valores de ganho para distinguir adequadamente o sinal do fundo usando as imagens das células de controle negativas e adquirir uma imagem parada.NOTA: Idealmente, os níveis de fluorescência de fundo são determinados com base em uma placa de controle negativa processada em paralelo com uma sonda RNA de sentido não-direcionada. As configurações de ganho são ajustadas para que esta placa pareça completamente preta (correspondente aos níveis de fundo), em seguida, mantida constante para outras placas imagens desse lote experimental. 7. Processamento de dados NOTA: O processamento de dados foi realizado usando o software Nikon Elements. Abra a imagem de cálcio de 2 h a partir da etapa 3.7. Identifique os pixels correspondentes a cada célula individual selecionando Binary > Spot Detection > Bright Spots. Certifique-se de que o canal FITC está selecionado. Círculos coloridos aparecerão sobre células individuais depois que essa camada for gerada. Ajuste os parâmetros de distribuição e tamanho da célula para que o maior número possível de células sejam reconhecidos e associados a um identificador único. Rastreie as células em todos os quadros da imagem navegando para View > Analysis Controls > Tracking Options. Defina 5 quadros como a diferença máxima entre as faixas, exclua objetos associados a menos de 600 quadros e selecione a opção Fechar lacunas. Selecione Binários de Rastreamento para aplicar rastreamento celular à imagem. Depois que as células forem rastreadas, exclua manualmente qualquer objeto que não corresponda a uma célula individual (por exemplo, um aglomerado de células). No entanto, os pontos de dados não devem ser excluídos de análises posteriores com base na morfologia do traço de atividade de cálcio. No painel de imagem, selecione View Overlay > Mostrar ID de objeto binário. Role até o final da imagem (Quadro 901) e selecione Editar > Criar Exibir Snapshot (8bitRGB)> Quadro atual > OK. Isso criará um instantâneo do último quadro da imagem com o ID binário associado de cada célula visível. Salve esta imagem. Exportar dados da série de tempo selecionando todos os objetos seguidos por Dados de Exportação para Excel. Salvar a saída como um arquivo CSV. Abra a imagem DO PEIXE. Otimize a detecção de pontos como nas etapas 7.1-7.2, usando o canal TRITC em vez do canal FITC. Exclua manualmente quaisquer binários atribuídos incorretamente e selecione Resultados de Medição Automatizadas > Medição de atualização para calcular a intensidade do sinal de cada célula. Exporte um instantâneo de imagem e tabela de dados repetindo as etapas 7.5 e 7.6. Crie uma planilha onde a Coluna A é rotulada de FISH Binary ID e a Coluna B é rotulada de ID Bináriode Cálcio . Abra as imagens exportadas nas etapas 7.5 e 7.7. Para cada objeto identificado na imagem FISH (passo 7.7), registre o ID binário na Coluna A. Em seguida, localize a célula correspondente na imagem de cálcio (passo 7.5) e registre que o ID binário na Coluna B. As células que não podem ser identificadas com confiança em ambas as imagens não devem ser adicionadas à planilha.NOTA: Pode ser útil usar um programa de edição de fotos como o Adobe Photoshop ou editor de imagens GIMP para abrir ambas as imagens, tornar uma semitransparente e sobrepor-as à sua imagem parceira para identificar e vincular mais facilmente os dois IDs binários associados a cada célula. Para cada célula identificada, coleto (manualmente ou com um script) seus dados de cálcio em série de tempo (associados ao ID Binário de Cálcio e exportados na etapa 7.6) e seus dados de expressão genética (associados ao ID binário FISH e exportados na etapa 7.7).NOTA: O processamento e análise de dados a jusante podem envolver a repartimento desses dados em uma única tabela de dados e a aplicação de uma série de técnicas analíticas, incluindo contagem de picos, análise fractal e entropia markovian que permitem ao pesquisador discernir novos padrões de atividade de cálcio 17,18.