Humanisierte NOG-Mäuse für intravaginale HIV-Exposition und Behandlung von HIV-Infektionen
Summary
Wir haben ein Protokoll zur Generierung und Bewertung eines humanisierten und humanen, mit Immundefizienz virusinfizierten NOG-Mausmodells entwickelt, das auf Stammzelltransplantation, intravaginaler exposition menschlicher Immundefizienzviren und Tropfen-Digital-PCR-RNA basiert. Quantifizierung.
Abstract
Humanisierte Mäuse bieten eine ausgeklügelte Plattform, um die Virologie des Humanen Immundefizienzvirus (HIV) zu untersuchen und antivirale Medikamente zu testen. Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung eines menschlichen Immunsystems bei erwachsenen NOG-Mäusen. Hier erklären wir alle praktischen Schritte von der Isolierung von Nabelschnurblut abgeleiteten menschlichen CD34+ Zellen und deren anschließende intravenöse Transplantation in die Mäuse, die Manipulation des Modells durch HIV-Infektion, Kombination antiretrovirale Therapie ( cART) und Blutentnahme. Etwa 75.000 hCD34+ Zellen werden intravenös in die Mäuse injiziert und das Niveau des menschlichen Chimären, auch als Humanisierung bekannt, im peripheren Blut wird längs für Monate durch Durchflusszytometrie geschätzt. Insgesamt ergeben 75.000 hCD34+ Zellen 20%–50% menschliche CD45+ Zellen im peripheren Blut. Die Mäuse sind anfällig für intravaginale Infektionen mit HIV und Blut kann einmal wöchentlich zur Analyse und zweimal monatlich für längere Zeit entnommen werden. Dieses Protokoll beschreibt einen Test zur Quantifizierung der Plasmaviruslast mit Tropfen digitaler PCR (ddPCR). Wir zeigen, wie die Mäuse effektiv mit einem Standard-pflege-cART-Regime in der Ernährung behandelt werden können. Die Lieferung von cART in Form von regulärem Maus-Chow ist eine signifikante Verfeinerung des Versuchsmodells. Dieses Modell kann sowohl zur präklinischen Analyse systemischer als auch topischer Präexpositionsprophylaxeverbindungen sowie zur Erprobung neuartiger Behandlungen und HIV-Heilungsstrategien verwendet werden.
Introduction
Das Humanimmundeficiency Virus (HIV) ist eine chronische Infektion mit mehr als 37 Millionen Infizierten weltweit1. Die kombinationsantivirale Therapie (cART) ist eine lebensrettende Therapie, aber eine Heilung ist immer noch gerechtfertigt. Daher sind Tiermodelle erforderlich, die das menschliche Immunsystem und seine Reaktionen spiegeln, um die weitere HIV-Forschung zu erleichtern. Mehrere Arten von humanisierten Mäusen, die in der Lage sind, Zell- und Gewebetransplantation zu unterstützen, wurden durch Transplantation menschlicher Zellen in stark immundefizienten Mäusen2entwickelt. Solche humanisierten Mäuse sind anfällig für HIV-Infektionen und stellen eine wichtige Alternative zu nichtmenschlichen Primaten-Simian-Immundefizienz-Virusmodellen, da sie billiger und einfacher zu bedienen sind als nichtmenschliche Primaten. Humanisierte Mäuse haben die Forschung in HIV-Virusübertragung, Pathogenese, Prävention und Behandlung3,4,5,6,7,8,9,10,11erleichtert.
Wir präsentieren ein flexibles humanisiertes Modellsystem für die HIV-Forschung, das durch die Transplantation von nabelschnurblutabgeleiteten menschlichen Stammzellen in Mäuse des NOD entwickelt wurde. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) Hintergrund. Abgesehen davon, dass es nicht-fetaler Herkunft ist, ist das praktische Bioengineering dieser Mäuse im Vergleich zu den mikrochirurgischen Verfahren, die an der Transplantation des Blut-Leber-Thymus -Konstrukts (BLT) beteiligt sind, weniger technisch anspruchsvoll.
Wir zeigen, wie man eine HIV-Infektion durch intravaginale Übertragung herstellt und wie man die Plasmaviruslast mit einem empfindlichen Droplet-Digital PCR(ddPCR)-basierten Setup überwacht. Anschließend beschreiben wir die Etablierung von Standard-cART als Teil der täglichen Maus-Diät gegeben. Ziel dieser kombinierten Methoden ist es, den Stress für die Tiere zu verringern und groß angelegte Experimente zu erleichtern, bei denen die Fürstin des Umgangs mit jedem Tier begrenzt ist12.
Beim Menschen verursacht ein CCR5-Genotypmit 32/32 oder CCR532/32 eine verminderte Anfälligkeit für HIV-Infektionen mit Sender-/Gründerviren13, und es müssen einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wenn humanisierte Mäuse mit Stammzellen für HIV-Studien bioengineering entwickelt werden. Dies gilt insbesondere in unserer Region, weil natürlich vorkommende Varianten im CCR5-Gen, insbesondere 32 Deletionen, in skandinavischen und baltischen Ureinwohnern häufiger sind als im Rest der Welt14,15. So enthält unser Protokoll einen einfachen, hochdurchsatzhohen Assay zum Screening von hämatopoetischen Stammzellen für CCR5-Varianten vor der Transplantation.
Für die intravaginale Exposition wählten wir den Sender/Gründer R5 Virus RHPA4259, isoliert von einer Frau in einem frühen Stadium der Infektion, die intravaginal infiziert war16. Wir setzten die Mäuse einer viralen Dosis aus, die ausreichte, um bei der Mehrheit der Mäuse eine erfolgreiche Übertragung zu erzielen, aber unter einer Übertragungsrate von 100 %. Die Wahl einer solchen Dosis ermöglicht einen ausreichenden Dynamikbereich in der Übertragungsrate, so dass antivirale Wirkungen eines Arzneimittelkandidaten zu geschützten Tieren in HIV-Präventionsexperimenten und einer verringerten Viruslast für Behandlungsstudien führen können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der stark immungeschwächte Mausstamm NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) eignet sich hervorragend für die Transplantation menschlicher Zellen und Gewebe. Sowohl angeborene als auch adaptive Immunbahnen bei diesen Mäusen sind beeinträchtigt. NOG- und NSG-Mäuse beherbergen eine Prkdc-Cid-Mutation, die zu einer fehlerhaften T- und B-Zellfunktion führt. Darüber hinaus fehlt diesen Mäusen eine funktionelle Interleukin-2-Rezeptor-Kette (gemeinsa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken den Mitarbeitern der Biomedicine Animal Facility an der Universität Aarhus, insbesondere Frau Jani Kér für die Erhaltung der Kolonien und für die Verfolgung von Mausgewichten. Die Autoren danken Professor Florian Klein für die Entwicklung von Standard-care cART und für die Beratung. Das folgende Reagenz wurde durch das NIH AIDS Reagenzprogramm, Abteilung AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (Kat. 11744) von Dr. John Kappes und Dr. Christina Ochsenbauer erhalten.
Materials
| Blue pad | VWR | 56616-031 | Should be sterilized prior to use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8022 | |
| CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7 | BD Bioscience | 557835 | |
| CD3 (clone OKT3) FITC | Biolegend | 317306 | |
| CD3 (clone SK7) BUV395 | BD Bioscience | 564001 | |
| CD34 (clone AC136) FITC | Miltenyi | 130-113-740 | |
| CD4 (clone SK3) BUV 496 | BD Bioscience | 564652/51 | |
| CD45 (clone 2D1) APC | Biolegend | 368511/12 | |
| CD8 (clone RPA-T8) BV421 | BD Bioscience | 562428 | |
| ddPCR Supermix for probes (no dUTP) | Bio-Rad | 1863025 | |
| DMSO | Merck | 10,02,95,21,000 | |
| DNAse | Sigma | D4263 | For suspension buffer |
| dNTP mix | Life Technologies | R0192 | |
| Dulbeccos phosphate-buffered saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | |
| EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II | Stemcell | 17896 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| FACS Lysing solution 10X | BD | 349202 | Dilute 1:10 in dH20 immediately before use |
| FACS tubes (Falcon 5 mL round-botton) | Falcon | 352052 | |
| Fc Receptor blocking solution (Human Trustain FcX) | Biolegend | 422302 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F8192-500 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17144002 | |
| Flowjo v.10 | |||
| Gauze | Mesoft | 157300 | Should be sterilized prior to use |
| Heating lamp | Custom made | ||
| Hemacytometer (Bürker-Türk) | VWR | DOWC1597418 | |
| Isoflurane gas | Orion Pharma | 9658 | |
| LSR Fortessa X20 flow cytometer | BD | ||
| Microcentrifuge tubes, PCR-PT approved | Sarstedt | 72692405 | |
| Mouse cART food | ssniff Spezialdiäten GmbH | Custom made product | |
| Mouse restrainer | Custom made product | ||
| Needle, Microlance 3, 30G ½" | BD | 304000 | |
| NOG mice NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac | Taconic | NOG-F | |
| Nuclease-free water | VWR chemicals | 436912C | |
| Nucleospin 96 Virus DNA and RNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740691 | |
| PCR-approved microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.692.405 | |
| Penicillin-Streptomycin solution 100X | Biowest | L0022-100 | |
| Phusion Hot Start II DNA polymerase | Life Technologies | F549S | |
| Pipette tips, sterile, ART 20P Barrier | ThermoScientific | 2149P | |
| Proteinase K | NEB | 100005398 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| QX100 Droplet Generator | Bio-Rad | 1886-3008 | |
| QX100 Droplet Reader | Bio-Rad | 186-3003 | |
| RBC lysis solution | Biolegend | 420301 | |
| RNase-free DNAse size F + reaction buffer | Macherey-Nagel | 740963 | |
| RNAseOUT Recombinant Ribonuclease inhibitor | ThermoScientific | 10777-019 | |
| RPMI | Biowest | L0501-500 | Dissolve in H20 |
| Softject 1 mL syringe | Henke Sass Wolf | 5010-200V0 | |
| Superscript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080044 | |
| Thermoshaker | VWR | 89370-910 | |
| Trypane blue | Sigma | T8154 | |
| Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| Virkon S (virus disinfectant) | Dupont | 7511 |
Riferimenti
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