Analisi della metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchietratta con Vescicoli Extracellulari Derivati dall'Osteosarcoma

La metilazione del DNA è una grande modifica epigenetica che si verifica nelle cellule umane. La metilazione del DNA si riferisce al collegamento dei gruppi metilici ai residui di citosina nei dinucleotidi CpG. Tali dinucleotidi si trovano di solito negli ammassi (isole CpG) nella regione 5′ dei geni¹. Nelle cellule normali, la maggior parte di questi dinucleotidi esiste in uno stato non metilato, che consente la trascrizione del DNA. Per inciso, molti tumori sono associati con le isole CpG ipermetillate e il silenziamento trascrittomico², soprattutto nei geni soppressori tumorali, che a loro volta contribuiscono a vari segni distintivi del cancro³.

D’altra parte, lunghi elementi nucleari interspersati-1 (LINE-1 o L1) sono elementi di DNA ripetitivi e trasponibili che normalmente hanno alti livelli di metilazione nelle isole CpG. La metilazione di LINE-1 previene la traslocazione e aiuta a mantenere l’integrità del genoma. In diversi tipi di cancro, LINE-1 è ipometilato, con conseguente attivazione e successiva instabilità cromosomica retrotrassima mediata⁴. LINE-1 rappresenta quasi il 17% del genoma umano⁵e il suo stato di metilazione può fungere da indicatore dei livelli di metilazione genomica globale⁶. Si ritiene che l’ipometilazione line-1 globale preceda la transizione delle cellule a un fenotipo tumorale⁷; quindi, promette come potenziale marcatore per l’insorgenza precoce del cancro.

Attualmente, ci sono diversi metodi per l’analisi della metilazione, tra cui la pigzoncazione, la metilazione specifica PCR, microarray e l’immunoprecipitazioni della cromatina¹. L’uso del sequenziamento di nuova generazione ha anche permesso di incorporare approcci a livello di genoma per la rilevazione della metilazione del DNA. Molti di questi metodi si basano sul DNA trattato con bisulfite, in cui le citosine non metilate vengono convertite in uracile e le citosine metilate rimangono invariate. Tuttavia, lavorare con il DNA trattato con bisulfite ha diverse insidie, come conversioni incomplete di citosine non metilate in uracili, amplificazione di biasima delle sequenze e errori di sequenza⁸.

Nell’amplificazione della sonda specifica per la metilazione (MSPA), le sonde composte da due oligonucleotidi prendono di mira sequenze di DNA contenenti un sito di restrizione (GCGC) per l’enzima di restrizione sensibile alla metilazione HhaI⁹. Dopo che le sonde si ibridano al DNA, ogni campione viene diviso in due set. Le sonde nel primo set vengono sottoposte a legatura, mentre le sonde nel secondo set vengono sottoposte a legatura seguita da una digestione mediata di HhaI in siti CGCG non metilati. Entrambi i set di campioni vengono poi amplificati dalla PCR e i prodotti sono separati da elettroforesi capillare. Le sonde nei siti non metilati vengono digerite da HhaI e non vengono amplificate durante la PCR, con conseguente assenza di segnali di picco. Al contrario, le sonde nei siti metilati sono protette dalla digestione e sono quindi amplificate durante la PCR, generando successivamente segnali di picco¹⁰.

MSPA presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi. In primo luogo, richiede una bassa quantità di DNA (50-100 ng) ed è adatto per l’analisi del DNA da campioni incorporati di paraffina fissati in formalina¹⁰. Non richiede DNA trattato con bisulfiti; infatti, non è adatto per il DNA che viene modificato in questo modo. Molti campioni possono essere analizzati contemporaneamente e le sonde MSPA possono essere progettate in modo che si rivolgono a più geni o sequenze contemporaneamente. Inoltre, le sonde sono specifiche e sensibili per il DNA metilato come il sito di restrizione HhaI corrisponde a una sequenza che è tipica delle isole CpG¹⁰.

Questo studio ha studiato gli effetti delle vesciche extracellulari derivate dall’osteosarcoma (OS) (EV) sulla metilazione LINE-1 nelle cellule staminali mesenchimale derivate da tessuto adiposo (AT-MSC; Figura 1). Gli EV sono su nanoscala, vesciche legate a membrana secrete dalla maggior parte dei tipi di cellule. Trasportano proteine, lipidi, mRNA, microRNA e molecole aggiuntive dalle cellule dei genitori^11,12. Gli EV mediano la comunicazione intercellulare e svolgono ruoli importanti in diverse condizioni patofisiologiche^13,14. Uno studio recente ha dimostrato che gli EV derivati dal cancro possono trasferire line-1 attivi alle cellule ricevente¹⁵. È stato riferito in precedenza che i veicoli elettrici della linea cellulare HOS-143B possono alterare lo stato di metilazione di LINE-1 nelle MSC, oltre ad altri effetti genetici¹⁶.

Quando si coltivano cellule per l’isolamento EV, è importante utilizzare il siero bovino fetale impoverito di EV [FBS] nel mezzo di crescita, poiché gli EV derivati da FBS possono interferire con i veicoli elettrici provenienti da altre fonti e ostacolare i risultati^17,18. L’ultracentrifugazione è uno dei metodi più comuni per esaurire i VE da FBS. Si tratta di una procedura relativamente semplice ed economica rispetto ad alternative come l’ultrafiltrazione e l’esaurimento commerciale di FBS¹⁹. Qui, il protocollo dimostra anche come preparare FBS impoverito da EV per ultracentrifugazione.

In questo articolo viene presentata un protocollo dettagliato per le tecniche di cui sopra, dall’isolamento dei veicoli elettrici da una linea cellulare del sistema operativo all’analisi della metilazione di LINE-1 negli MSC trattati con OS-EV (Figura 1).