Aplicando imagens de células vivas e tomografia crio-elétron para resolver características espaciales do Sistema de Secreção Legionella pneumophila Dot/ICM

Legionella pneumophila (L. pneumophila), o agente etiológico da doença dos Legionários, habita reservatórios de água doce, onde as bactérias se propagam infectando e replicando dentro de protozoários aquáticos de natação livre. L. pneumophila causa surtos de doenças em humanos quando ocorre inalação de bactérias aerossolizadas de fontes de água potável. Nas células infectadas, a subversão das vias hospedeiras permite que a L. pneumophila atrase a maturação endocítica do vacúolo em que reside e promova a biogênese de um compartimento celular que suporta a replicação bacteriana. Este processo é conduzido por um sistema especializado de secreção de tipo bacteriano IVB (T4BSS) conhecido como Ponto/Icm e seu repertório de mais de 300 proteínas “eficazes” que são translocadas no citosol hospedeiro durante a infecção para facilitar a manipulação das funções celulares^1,2,3,4,5. Mutantes sem um aparelho funcional Dot/Icm não conseguem entregar os efeitos no citosol hospedeiro, são defeituosos para replicação intracelular e são aviudores em modelos animais da doença^6,7.

Muitas espécies bacterianas desenvolveram máquinas multicomponentes extremamente complexas e dinâmicas que são necessárias para processos de infecção. Outros T4BSS como o sistema Dot/Icm também são essenciais para a replicação intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii e Rickettsiella grylli. Embora o T4BSS esteja evolutivamente relacionado aos sistemas iva do tipo prototípico, que mediam a transferência de DNA e podem fornecer um repertório limitado de proteínas eficazes, o sistema Dot/Icm tem quase o dobro de componentes da máquina e fornece uma grande variedade de efeitos. Presumivelmente, essa expansão no número de componentes permitiu que o aparelho Dot/Icm acomodasse e integrasse facilmente novos efeitos^8,9.

Recentemente usamos a tomografia crio-elétron (crio-ET) para resolver a estrutura do aparelho Dot/Icm in situ e mostramos que ele forma um canal de abrangência de envelopes de células que se conecta a um complexo citoplasmático. Análises posteriores revelaram que o citosolicatat ATPase DotB associa-se ao sistema Dot/Icm no pólo celular L. pneumophila através de interações com o citosolicatATPase DotO. Descobrimos que o DotB apresenta um movimento citosólico na maioria das células bacterianas, indicando que este ATPase está presente em uma população citossólica dinâmica, mas também se associa aos complexos polares do Dot/Icm. Além disso, DotO forma uma montagem hexamérica de dimers DotO associados com o complexo de membrana interna, e um Hexamer DotB se junta à base deste complexo citoplasmático. A montagem do complexo energético DotB-DotO cria um canal citoplasmático que direciona a translocação de substratos através do T4SS (Figura 1)¹⁰.

Apesar desses avanços recentes, pouco se sabe sobre como funciona o sistema Ponto/Icm e como cada proteína se reúne para formar um aparelho ativo⁸. Descobrir os circuitos regulatórios do Ponto/Icm T4SS é fundamental para compreender os mecanismos moleculares das interações hospedeira-patógena. Portanto, discutimos como usar a microscopia de células vivas e crio-ET para detectar e caracterizar componentes essenciais do sistema L. pneumophila Dot/Icm que são marcados com a super pasta GFP (sfGFP). Utilizando microscopia quantitativa de fluorescência, a localização polar do DotB será definida em um tipo de fundo selvagem ou quando o sistema tipo IV for excluído. A microscopia de lapso de tempo será usada para quantificar diferenças na localização e dinâmica entre os ATPas citosolic do TT/ICM.

A aplicação combinada de duas abordagens complementares, como imagem ao vivo e crio-ET, proporciona uma vantagem em comparação com outros sistemas in vitro. Ambos os métodos são realizados em células intactas e preservam o ambiente natural do T4BSS, minimizando assim a interrupção da estrutura nativa durante a preparação da amostra. Como a superexpressão das proteínas pode prejudicar a estequiometria do aparelho de secreção, as fusões sfGFP são devolvidas através da troca alélica ao cromossomo Legionella para que cada fusão seja codificada em cópia única e a expressão seja conduzida pelo promotor endógeno. A visualização de fusões codificadas cromossomicamente permite quantificação do nível exato de proteína sendo expressa em um ponto de tempo definido. O Cryo-ET também tem muitas vantagens para determinar a estrutura dos sistemas de secreção. A vantagem mais notável é que as amostras crio-ET são compostas de células intactas congeladas que preservam complexos nativos no contexto da arquitetura celular bacteriana. Consequentemente, o crio-ET pode ser preferível às abordagens de purificação bioquímica, que extraem complexos de membrana e podem retirar proteínas periféricas do aparelho central ou modificar a estrutura geral. Além disso, a marcação de uma proteína de interesse com uma proteína volumosa como o sfGFP adiciona uma massa que é detectável pelo crio-ET e pode auxiliar no mapeamento dos diferentes subcomplexos do aparelho Dot/Icm na estrutura obtida pelo crio-ET.

Esta abordagem é uma poderosa ferramenta para descobrir informações estruturais sobre complexos multimoleculares que se reúnem na membrana celular bacteriana. A interpretação das estruturas elucidadas usando essas técnicas ajudará o campo a entender como funcionam os componentes T4BSS, por que tantos componentes são necessários para a função, como os componentes interagem dentro do complexo maior e quais funções esses subconjuntos funcionam.