Den mänskliga blod – hjärnbarriären förhindrar selektivt penetration av hydrofila molekyler och patogener i hjärnan. Flera patologier, inklusive hjärnhinneinflammation och postoperativa delirium, är associerade med en ökad permeabilitet av blod – hjärnbarriären. Här beskriver vi en endotelcellkulturmodell för att testa barriärpermeabiliteten genom mikrobiell traversal.
Den mänskliga blod – hjärnbarriären (BBB) kännetecknas av en mycket låg permeabilitet för biomolekyler för att skydda och reglera hjärnans metabolism. BBB bildas huvudsakligen av endotelceller inbäddade i kollagen IV och fibronectin-rika källarmembran. Flera patologier beror på dysfunktion av BBB följt av mikrobiell traversal, orsakar sjukdomar som hjärnhinneinflammation. För att testa effekten av flera parametrar, inklusive olika läkemedel och bedövningsmedel, på permeabilitet en BBB vi etablerade en ny mänskliga cell kultur modell härma BBB med mänskliga hjärnan mikrovaskulära endotelceller. Endotelcellerna odlas på kollagen IV och fibronectin-belagda filterenheter tills sammanflödet och kan sedan behandlas med olika föreningar av intresse. För att visa en mikrobiell traversal, den övre kammaren med den apical ytan av endotelcellerna inokuleras med bakterier. Efter en inkubationstid pläteras prover av den nedre kammaren på agarplattor och de erhållna kolonierna räknas, varigenom antalet kolonier korrelerar med BBB:s genomsläpplighet. Endogena cellulära faktorer kan analyseras i denna experimentella uppsättning för att belysa grundläggande cellulära mekanismer i endotelceller som bidrar till BBB. Dessutom gör denna plattform det möjligt att utföra en skärm för föreningar som kan påverka permeabiliteten hos endotelcellerna. Slutligen, bakteriell traversal kan studeras och kopplas till olika patologier, såsom hjärnhinneinflammation. Det kan vara möjligt att utöka modellen och analysera vägarna hos bakterierna genom BBB. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll över den beskrivna metoden för att undersöka BBB:s genomsläpplighet.
Den mänskliga BBB är en unik gräns för hjärnvävnad, separera hjärnan från blodet. Det reglerar strikt passagen av större och hydrofila molekyler, blockerar paracellulär diffusion och upprätthåller hjärnanhomeostas. Det skyddar också hjärnan från plasmafluktuationer, toxiner, mikrober och styr inflammatoriska celler som en del av immunsystemets (CNS) immunitet. Sedan upptäckten för ett sekel sedan1, många studier har genomförts för att förstå strukturen och funktionen av BBB. Den komplexa interaktioner av celler, proteiner, och signaler från hjärnan och blodet kräver ytterligare undersökning och modeller.
Den mänskliga BBB består av tre celltyper: hjärnan mikrovaskulära endotelceller (BMECs), pericyter och astrocyter2,3. BMECs skiljer sig från majoriteten av endotelcellerna i kroppen genom att de har ett stort antal snäva korsningar och vidhäftningar korsningar4,låg pinocytotisk aktivitet2,5, och en kontinuerlig källare membran6,7 för att blockera paracellulär diffusion. Små lipofila molekyler kan sprida sig och passera BBB efter deras koncentrationsgradient; större och hydrofila molekyler kommer in eller lämnar hjärnan endast genom polariserade uttryckta selektiva transportsystem8. Denna förordning resulterar i en hög transendotel elektrisk tång (TEER) på 1.500-2.000 Ω·cm2 som är omvänt korrelerade till permeabilitet9,10. Även om BMECs bygga en tät barriär, kan de reagera på lokala och perifera signaler11,12. Det finns en nära interaktion mellan BMECs och astrocyter13; astrocyt slutfötterna bygga ett lager runt kärlen och inducera bildandet av snäva korsningar13,14. De är involverade i BBB-mognad med olika faktorer, inklusive omvandling av tillväxtfaktor-β (TGF-β)15,16. Dessutom spelar pericyter en nyckelroll i regleringen av angiogenes17 och förhindra apoptos av endothelium i cellulär differentiering18 (figur 1). De är inbäddade i källaren membranet och ger strukturell stabilitet i kärlväggen19.
Figur 1: Den schematiska strukturen i blod – hjärnbarriären. Den unika strukturen hos den mänskliga BBB består av tre olika celltyper. Mikrokärlslumen omges av endotelceller, som är berikade i snäva korsningar, och är inte fenestrated. De är inbäddade i källaren membranet, som pericyter. Dessa celler är viktiga för kärlväggens strukturella stabilitet och spelar en roll i BBB:s utveckling bredvid astrocyterna. Deras ändfötter bygger ett nära lager runt fartyget och stöder byggandet av snäva korsningar. Alla komponenter i BBB är viktiga för fysiologisk funktionalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Många olika patologier är relaterade till kollapsen av BBB (t.ex. septisk encefalopati). De drabbade patienterna har ökat proteinnivåerna i ryggmärgsvätskan20, och hjärnparenkymen hos drabbade gnagare visar ett ökat upptag av märkt kolloidal järnoxid och aminosyror21,22. Dessa resultat pekar mot en ökad permeabilitet av BBB som sker tillsammans med en ökad pinocytos is i BMECs21 och endotel aktivering23. En annan tillhörande patologi relaterad till en förändrad BBB är hjärnhinneinflammation, en medicinsk nödsituation och en komplex inflammation tillsammans med cerebral ödem som kan leda till neuronal cell död. Den primära ingångsplatsen för cirkulerande bakterier är tänkt att vara mikrokärlen24; BBB förhindrar dock att bakterier kommer in. BBB:s permeabbarhet är inte alltid kopplad till en ökning av experimentell hematogenous hjärnhinneinflammation25 och mekanismerna kan vara multifaktoriella. Tillfällighet av sepsis med postoperativa delirium (POD)26 och associering med preoperative infektioner27,28 indikerar behovet av en BBB modell som möjliggör direkt exponering för bakterier för att få en bättre förståelse för bakteriell patogenes.
Det finns många luckor i förståelsen och kvantifiera den mikrobiella traversal genom BBB. Därför utvecklade vi en modell som möjliggör en bekväm testning av olika faktorer och tillstånd med ett direkt samband mellan bakteriell traversal och influenser på bbbens genomsläppbarhet. Tidigare arbete fokuserade på paracellulära permeabilitet och inkluderade TEER-mätning och spårämnesflöde. Dessutom analyserades makromolekyltransport en av konjugerade molekyler eller antikroppar, där olika modeller som endast använder endotelceller eller kombinationer med astrocyter och pericyter utvecklades. På grund av svårigheten att regelbundet få mänsklig vävnad används många djurbaserade modeller. Hjärnan endotelceller av nötkreatur och svin ursprung bildar snäva monolayers med en hög TEER som bildar välformad apical-basala polaritet och är lämpade för undersökningar av små molekyler transport genom BBB. Proteinerna skiljer sig i följd från deras mänskliga homologer29,30, vilket gör undersökningen av terapeutiska antikroppar svårt. Av denna anledning kan murine eller mänskliga modeller kultur vara att föredra. Mus eller råttor som provkällor har fördelen av att erhållas från välkarakteriserade arter men ger få celler för studieändamål. Detta kan kringgås genom användning av förevigade mus hjärnan endoteliom (END) cellinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primära odlade celler från mänsklig vävnad är svåra att få och att hantera regelbundet. Därför är de flesta mänskliga cellulära modeller som används i forskning som undersöker den mänskliga BBB förevigade endotelcellinjer. En publicerad cellinje är mänskliga cerebrala mikrovaskulära endotelcellinjen hCMEC/D3, som är väl lämpad för studier av läkemedelsupptag och är lätt att hantera. Cellerna bygger ett monolayer och uttrycker de karakteristiska snäva kopplingsproteiner i BBB34, medan uttrycksnivån för claudin-5 rapporteras vara lägre än i intakta mikrofartyg35 och många specifika transportörer har upptäckts på avskriftsnivå36 samt i proteomiska studier34. En relativt låg TEER i intervallet 30-50 Ω·cm2 är fortfarande en utmaning37. En annan källa för hjärnan endotelceller är mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs)38 och mänskliga navelsträngsblod-härledda stamceller av cirkulerande endotel stamceller och hematopoietiska härstamningar39,40. Båda protokollen av differentiering resulterar i snäva cellmonolayers och kick TEER värderar (e.g., 1.450 Ω·cm2 i co-cultures)38. Dessa stamcellsmodeller kräver extrem vård för odling, men erbjuder ändå möjlighet att studera påverkan av reglerande hormoner41 eller sjukdomar med genetisk bakgrund42 på BBB utveckling.
I denna studie etablerade vi en förevigad transfected mänskliga hjärnan mikrovaskulären celllinje, THBMEC43, att efterlikna BBB och att studera bakteriell traversal. Celler är seedade på ett filter och odlas till 100% sammanflödet i denna cell kultur modell. Bakterier är inokuleras i den övre delen av cellodlingskammaren. Vi använder Escherichia coli (E. coli)i vår provstudie på grund av den höga incidensen av E. coli hjärnhinneinflammation44. Det har visat sig att den lägsta permeabiliteten hos cellmonolayer sker mellan dag 13 och dag 15 efter att45. Därför utförs behandling av THBMEC monolayer efter denna tid och bakterier inokuleras efteråt i mediet på monolayers apical yta. Efter en inkubationstid kvantifieras bakterier som kunde korsa barriären via pläteringsmedium med bakterierna på agarplattor och räknar kolonierna. Ett ökat antal kolonier korrelerar med högre bakteriell traversal genom BBB. TEER är ca 70 Ω·cm246. Det är dock inte nödvändigt att mäta Teer i den beskrivna metoden. Även om det är ett väletablerat värde för bbbens permeabilitet, verkar det inte ha någon inverkan på bakteriens genomfärd genom BBB. Obehandlade celler fungerar som en kontroll av täthet i vår modell. Det har visats i tidigare arbete att cellerna kan reagera på proinflammatoriska cytokiner och uttrycka typiska snäva korsningproteiner47. Detta möjliggör sammansatt screening och validering av en större uppsättning transportörsubstrat och receptorer.
Begränsad insikt i patogenesen vid mikrobiell traversal begränsar vidareutveckling av terapier för POD eller hjärnhinneinflammation. Dödligheten och sjukligheten hos dessa sjukdomar kräver bättre patientbehandling, kräver forskning av de underliggande mekanismerna och behöver en robust plattform för sammansatt screening. Multifaktorial händelserna kan studeras med mänskliga BMECs. Flera framgångsrika rapporterade isoleringsförfaranden för BMECs från ett antal arter har visat en förlust av cellernas egenskaper molekylär signatur52,53. De beskrivna THBMECs i detta förfarande transfected i mycket tidiga passager, där de uppvisade specifika hjärnan endotel cell egenskaper och bevarade dem43. Detta är viktigt, eftersom inte alla steg i de drabbade vägarna har upptäckts hittills, och denna modell verkar efterlikna konventionella BMECs. Vår presenterade modell visar direkta influenser på BMECs och den mikrobiella traversal genom BBB.
Hanteringen av THBMEC-celler är enkel, och den nödvändiga tekniska utrustningen finns i de flesta life science laboratorier. Vår modell möjliggör en omedelbar start av utredningsförfaranden efter att THBMECs har byggt en stram monolayer. Användningsområdena kan vara omfattande på grund av möjliga kombinationer mellan nya tester och konventionella analyser som TEER-mätning eller märkning med spårämnen54. Det är också möjligt att lägga astrocyter eller pericyter för att göra en co- eller triple-culture modell. Påverkan av läkemedel på den mikrobiella traversal kan också testas i vår modell genom att behandla THBMECs med föreningar innan man inokulera den övre kammaren med bakterier. I själva verket är det möjligt att köpa skär med filter för 96 brunnsplattor som möjliggör automatisering av förfarandet. Detta kan underlätta genomförandet av höggenomströmning av läkemedel screening system för att påskynda upptäckten av läkemedel mot de nämnda sjukdomarna och att minska biverkningar na på BBB under läkemedelsutveckling.
Ett kritiskt steg i den presenterade metoden är inkubationstiden efter att ha lagt till bakterierna i den övre kammaren. Det är viktigt att använda timmar som tidslinjer i protokollet, eftersom genereringstiden för E. coli bara är 20 min55. Annars kan användningen av olika tidpunkter leda till vilseledande resultat. Det finns också en möjlig risk för kontaminering mellan övre och nedre kammaren under bakterieexponeringen om plattorna inte hanteras med försiktighet. Alla ändringar av 12 brunnplattan vid denna punkt kan förorena mediet i den nedre kammaren.
E. coli är en välkänd, mycket vanlig orsak till bakteriell hjärnhinneinflammation. Ytterligare undersökningar bör testa olika bakterier som också är associerade med hjärnhinneinflammation, såsom Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Dessa verkar använda olika mekanismer för att korsa BBB och måste förstås bättre för behandling av patienter. Hos äldre patienter ökar incidensen för POD26 samt antalet inträffar. Det är känt att det finns interaktioner mellan olika sjukdomar, särskilt systemiska som diabetes. I vår modell är det möjligt att simulera dessa villkor eller behandla cellerna innan du lägger till bakterierna.
Modellen begränsas av direkt kontakt mellan THBMECs och bakterier, och ytterligare forskning är nödvändig för att undersöka potentiella kontaktmekanismer för att upptäcka de inblandade vägar och proteiner. Det är dock möjligt att ta bort skär och skörda cellerna för ytterligare analys. Teer av modellen är lägre jämfört med stamcellsmodeller38,39,40. Vi bekräftade detta med hjälp av en bakteriell koncentration som inte korsade BBB i obehandlade celler efter 6 h.
Sammanfattningsvis representerar denna metod en robust plattform för att analysera spridning av bakterier genom BBB med potential att expandera den för hög genomströmning drog screenings.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Dr Maryam Hussain för tidigare arbete på denna metod, gruppen pd Dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) för att tillhandahålla THBMCs och Juliane Weber för kritiskt läsa manuskriptet. Denna studie stöddes av RTK 2155 (ProMoAge).
Agar – Agar | Carl Roth | 6494.3 | BioScience-Grade |
Autoclave | Systec | VX-150 | |
Bacteria E.coli strain GM2163 | Fermentas Life Sciences, Lithuania | ||
Photometer | Eppendorf | 6131 | |
Cells THBMEC | Group of M. F. Stins | ||
Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
Centrifuge Universal 320 | Hettrichlab | 1401 | |
Collagen IV | SIGMA Aldrich | C6745 | from human cell culture |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10311 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate | MERCK | 1065800500 | |
DMEM/F-12 | GIBCO/ Thermo Sc. | 11330032 | HEPES |
Falcon tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO/ Thermo Sc. | 10270 | value FBS -Brazil |
Fibronectin | SIGMA Aldrich | F0556 | solution human fibroblasts |
Heracell 150 CO2 Incubator | Heraeus | 50116047 | |
Incubator shaker I 26 New Brunswick | Eppendorf | M1324-0000 | |
Inoculation loop | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 641000 | |
LB Broth Base | GIBCO/ Thermo Sc. | 12780029 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
Microbial incubator B 6200 | Heraeus | 51015192 | |
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II | BIOAIR | 12469 | |
Microscope inverse | Zeiss | TELAVAL 31 | |
Micro tubes 2 ml | Sarstedt | 72,695,400 | |
Micro tubes 1,5 ml | Sarstedt | 72,706,400 | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 464-800 | |
Potassium chloride | Roth | HN02.3 | |
Potassium-di-hydrogen phosphate | Roth | P018.2 | |
Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
ThinCerts + Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 665631 | 12 well, pore size 3.0 µm |
Trypsin – EDTA | GIBCO/ Thermo Sc. | 15400054 | |
Vacuumpump Laboport | KNF | N 86 KT.18 |