인간의 다형성 핵 백혈구에 대한 황색포도상구균의 세포독성 정량화

건강한 기증자로부터 분리 된 정맥 혈액은 몬태나 주립 대학의 인간 과목에 대한 기관 검토 위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수집되었습니다. 모든 기부자는 이 연구에 참여하기 위해 서면 동의를 제공했습니다. 1. 인간 다형성 핵 백혈구의 정화 및 인간 혈청의 분리 참고: 모든 시약은 시판되는 내독소 검출 키트를 사용하여 내독소의 존재를 정기적으로 확인해야 하며 PMN의 원치 않는 프라이밍을 방지하기 위해 <25.0 pg/mL 내독소가 포함되어야 합니다. 50 mL의 3% dextran-0.9% NaCl (w/v), 35 mL 의 0.9% NaCl (w/v), 20 mL 의 1.8% NaCl (w/v), 12 mL의 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 솔루션, 그리고 20 mL의 주입-관개-실내 온도 온도. 인간 혈청을 분리하기 위해, 37°C에서 항응고제 없이 30분 동안 15 mL 유리 관에서 갓 뽑은 인간 혈액의 4 mL을 배양하였다. 배양 후, 원심분리기 샘플을 실온에서 10분 동안 2,000-3,000 × g로 시료합니다. 상부 혈청 층을 신선한 15 mL 원추형 원심분리기 튜브로 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 25 mL의 갓 그려진 헤파린화 (1000 단위 / mL) 전체 인간의 혈액과 실온 3 % dextran-0.9 % NaCl (1 : 1 비율)을 두 개의 복제 50 mL 원추 형 원심 분리튜브 (튜브 당 총 부피 50 mL)에 결합하십시오. 각 50 mL 원두 튜브를 부드럽게 흔들어 섞은 다음 실온에서 30 분 동안 방치하십시오. 실온에서 배양 한 후 두 개의 별도의 층이 나타납니다. 각 덱스란-혈액 혼합물의 최상층을 새로운 50mL 원추형 튜브와 원심분리기를 450 x g에서 10분 동안 저온 또는 무브레이크로 실온에서 옮깁니다. 조심스럽게 두 상피제를 흡인하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 폐기하십시오. 실온 0.9% NaCl의 2 mL에서 각 세포 펠릿을 부드럽게 재중단하고, 단일 50 mL 원엽 튜브에 재부유 된 펠릿을 결합한 다음 나머지 0.9 % NaCl (최종 부피 35 mL)을 추가하십시오. 핸드 파이펫을 사용하여 셀 현탁액 아래에 1.077 g/mL 밀도 그라데이션 용액의 실온 10 mL을 조심스럽게 언더레이합니다. 브레이크가 낮거나 없는 실온에서 450 x g에서 30분 동안 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 부드럽게 흡인합니다. 상급제는 앞서 설명한 바와 같이 수집될 수 있는 말초 혈액 단핵 세포를 함유할 것이다14. 실온의 20 mL에서 세포 펠릿을 재중단하여 적혈구를 용해시. 튜브를 30s로 흔들어 부드럽게 섞습니다. 적혈구의 포만은 탁도의 뚜렷한 감소를 동반할 것입니다. 즉시 실온에서 10 분 동안 450 × g에서 1.8 % NaCl (실온 [RT])의 20 mL를 추가하고 원심 분리기 샘플을 추가하십시오.참고: PMN 수율을 최대화하고 PMN 용해 및/또는 활성화를 방지하기 위해 적혈구 용해 후 PMN이 물에 만 남는 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. 조심스럽게 세포 펠릿을 방해하지 않고 상류를 흡인. RT RPMI 1640 배지의 2 mL에서 세포 펠릿을 부드럽게 다시 일시 중단하고 얼음 위에 놓습니다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산합니다. 얼음으로 차가운 RPMI로 1 x 107 셀/mL의 농도로 정제된 PMN을 다시 일시 중단하고 얼음위에 보관하십시오. 100 μL의 정제된 PMN(1 x 106 세포)과 300 μL의 얼음 차가운 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS)를 결합하여 2개의 복제 유동 세포 분석 튜브에 1 μL의 프로피듐 요오드하드 얼룩을 함유합니다. 플라즈마 멤브레인 손상에 대한 긍정적 인 제어를 위해, 0.5 % 트리톤 X-100 용액의 40 μL을 유세포 분석 튜브 중 하나에 넣고 철저히 혼합하십시오. 유세포분석기를 사용하여 정제된 세포의 순방향 산란, 측면 산란 및 프로피듐 요오드화 염색(535/617 nm에서 여기/방출 최대값)을측정합니다(그림 1).참고 : 전방 및 측면 산란 분석은 림프구와 단핵구의 원치 않는 인구를 식별합니다. 프로피듐 요오드화는 손상된 혈장 막과 프로피듐 요오드화 양성 세포의 발음 인구를 가지고 정제 된 PMN으로 만 얼룩세포를 사용해서는 안됩니다. 이러한 연구에서, 정제된 PMN은 정제된 세포의 >98%와 프로피듐 요오드화에 대해 5% 염색된 양성으로 구성된 경우에만 사용되었습니다. DPBS로 희석된 20% 절연 인간 혈청의 100 μL로 이 분석에서 사용될 개별 우물을 코팅하여 PMN 세포 독성 분석술에 대한 96 웰 플레이트를 준비합니다.참고: 플라스틱이나 유리에 직접 PMN을 도금하면 세포가 활성화됩니다. 0.05% Triton X-100을 수신할 미디어와 적어도 하나의 포지티브 컨트롤웰만 수신하는 적어도 하나의 네거티브 컨트롤을 포함해야 합니다. 37 °C에서 30 분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 코팅된 우물을 얼음으로 차가운 DPBS로 두 번 씻어 여분의 혈청을 제거합니다. 접시를 거꾸로 가볍게 두드려 잔여 DPBS를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 1 x 107 셀/mL에서 정제된 인간 PMN 100 μL을 코팅된 각 코팅(1 x 106 PMN/well)에 부드럽게 추가합니다. PMN이 적어도 5 분 동안 얼음에 접시를 배양하여 우물에 정착 할 수 있도록. 각 우물에서 세포의 균일 한 분포를 허용하고 PMN의 원치 않는 활성화를 방지하기 위해 얼음에 두고 플레이트 수준을 유지합니다. 2. 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 S. 아우레우스 세포 외 단백질의 세포 독성 분석 배양 S. 아우레우스를 37°C에서 설정된 교반 인큐베이터를 사용하여 트립틱 콩 국물(TSB)에서 하룻밤 동안. 이러한 연구를 위해, 별도의 150 mL Erlenmeyer 플라스크에서 TSB의 20 mL은 S. 아우레우스 균주 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S의 냉동 배양물로 접종하고 250 rpm에서 흔들림으로 약 14시간 동안 성장시켰다. 하위 배양 S. 아우레우스는 신선한 배지로 하룻밤 세균 배양의 1:100 희석을 수행함으로써. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달할 때까지 37°C에서 배양합니다.참고: 이러한 실험의 경우, 150 mL 에를렌마이어 플라스크에서 20 mL의 트립틱 대두 국물을 200 μL의 하룻밤 배양 USA300 또는 USA300ΔsaeR/S로 접종하고 37°C에서 5시간 동안 250 rpm에서 흔들면서 배양하였다. 박테리아가 초기 고정 성장 단계에 도달하면, 1mL의 배양 된 S. 아우레우스를 실온에서 5 분 동안 5,000 × g에서 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 및 원심 분리지로 옮긴다. 원심 분리 후, 상급체를 3 mL 주사기로 옮긴다. 0.22 μm 필터를 통해 얼음에 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리튜브에 초자연자를 전달합니다. 배양S아우레우스에사용되는 얼음 차가운 매체로 초월제의 연쇄 희석을 수행한다.참고: 표시된 실험의 경우, USA300 및 USA300ΔsaeR/S의 초자연자는 얼음으로 차가운 TSB로 4회 연속 1/2 로그 희석을 거쳤습니다. 1.15단계에서 얼음에 PMN이 함유된 96웰 플레이트의 개별 우물에 상수 샘플 또는 미디어만(음수 및 양성 대조군)을 부드럽게 추가합니다. 이러한 실험을 위해, USA300 또는 USA300ΔsaeR/S 상급 샘플의 10 μL을 각 웰에 첨가하였다. 부드럽게 바위 플레이트는 우물에 초자연적 인 물질을 분배하고 37 ° C에서 배양합니다. 원하는 시간에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음에 배치합니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다. 시료를 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 300 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다. 유세포분석(그림2A)를사용하여 프로피듐 요오드화 양성 PMN의 비율을 측정하였다. DNA에 결합하면, 프로피듐 요오드화물은 535/617 nm에서 여기 /방출이 있습니다. 3. S. 식세포증 다음 인간 다형성 핵 백혈구에 대한 아우레우스 세포 독성 분석 참고: 600 nm (OD600)에서광학 밀도에 의해 정의된 성장 곡선 및 박테리아의 농도는 이 분석실험을 시작하기 전에 시험될 S. 아우레우스 균주에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이러한 실험의 성공은 하위 배양 박테리아의 OD600을 사용하여 중간 기하수성장 단계에서 시험된 각 S. 아우레우스 균주의 동일한 농도의 일관된 수확을 요구한다. 단계 2.1.1 및 2.1.2에 기재된 바와 같이 S. 아우레우스 균주 및 하위 배양 박테리아의 하룻밤 배양을 시작한다. 수확 하위 배양 S. 아우레우스는 1mL의 배양 박테리아를 1.5 mL 의 미세원원지 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 5분 동안 5분 동안 원심분리를 하여 중간 기하급수적 성장에 도달하였다. 참고 : 우리의 성장 조건하에서, USA300 및 USA300ΔsaeR /S는 약 135 분 의 인큐베이션6후 중간 기하급수적 성장 단계에 도달했습니다. 상급자를 흡입하고, DPBS 의 1 mL에서 펠릿 박테리아를 재중단하고, 30초 동안 샘플을 소용돌이치며, 실온에서 5분 동안 5,000 ×g에서 원심분리를 하여 원심분리를 세척합니다. DPBS로 희석한 20% 인간 혈청의 1 mL에서 세균 펠릿을 재중단하고 37°C에서 교반하여 15분 동안 배양함으로써 S. 아우레우스를 Opsonize. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 5,000 x g에서 박테리아를 불협화시켰다. 상급자를 흡입하여 원심 분리 후 S. 아우레우스를 세척하고, 1 mL DPBS에서 펠릿 박테리아를 다시 일시 중단한 다음, 세균 펠릿이 완전히 분해될 때까지 샘플을 소용돌이치며 추가 30초가 추가로 추가로 증빙합니다. 실온에서 5 분 동안 5,000 × g의 원심 분리기 박테리아. 1 mL RPMI에서 opsonized S. 아우레우스 균주를 다시 일시 중단하고, 세균 펠릿이 완전히 분해 될 때까지 샘플을 소용돌이치며, 추가로 30 초를 얼음에 박테리아를 놓습니다. 얼음 차가운 RPMI로 원하는 농도로 opsonized S. 아우레우스 균주를 희석. 30 초 동안 소용돌이와 얼음에 배치합니다. 트립틱 콩 한천에 박테리아의 1:10 직렬 희석을 도금하여 opsonized S. 아우레우스의 농도를 확인합니다.참고: 이 분석실험에 사용된 박테리아의 농도 차이는 후속 PMN 혈장 막 투과성에 큰 영향을 미칠 수 있기때문에(그림 3A),테스트된 각 균주의 농도가 모든 실험에 대해 결정되고 균주 간에 동등한 것이 매우 중요합니다. 1.14단계에서 얼음 위에 있는 96웰 플레이트의 PMN에 각 S. 아우레우스 균주 또는 RPMI(양성 및 음성 대조물)의 100 μL/well을 부드럽게 추가합니다. 부드럽게 바위 판은 우물에 S. 아우레우스를 배포합니다. 4 °C15에서8 분 동안 500 × g에서 플레이트를 원심 분리하여 식세포증을 동기화합니다. 원심분리 직후 37°C에서 배양 플레이트(T = 0). 원하는 시간에 인큐베이터에서 접시를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 40 μL의 0.5% 트리톤 X-100을 포지티브 컨트롤에 잘 추가합니다. 샘플을 각 우물에서 위아래로 부드럽게 피펫하여 플레이트에 부착된 모든 PMN을 완전히 제거한 다음, 프로피듐 요오드화물 1 μL로 200 μL의 얼음 차가운 DPBS를 함유한 얼음에 세포 분석 튜브를 전달하기 위해 샘플을 이송합니다. 2.9단계에서 설명한 바와 같이 유세포분석을 사용하여 프로피듐 요오드화물 염색시 샘플을 분석합니다.