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Biologia

Purificación y análisis de las vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans

Published: March 31, 2020
doi:
10.3791/60596
, , , ,
1Department of Pathology,University of Washington

Summary

Este artículo presenta métodos para generar, purificar y cuantificar vesículas extracelulares de Caenorhabditis elegans.

Abstract

La secreción de pequeñas vesículas unidas a membranas en el entorno externo es un proceso fisiológico fundamental de todas las células. Estas vesículas extracelulares (EV) funcionan fuera de la célula para regular los procesos fisiológicos globales mediante la transferencia de proteínas, ácidos nucleicos, metabolitos y lípidos entre los tejidos. Los vehículos eléctricos reflejan el estado fisiológico de sus células de origen. Los vehículos eléctricos están implicados en tener funciones fundamentales en prácticamente todos los aspectos de la salud humana. Por lo tanto, la proteína EV y las cargas genéticas se están analizando cada vez más en busca de biomarcadores de salud y enfermedad. Sin embargo, el campo EV todavía carece de un sistema de modelo de invertebrado tratable que permita el estudio de la composición de la carga EV. C. elegans es muy adecuado para la investigación de vehículos eléctricos porque secreta activamente los vehículos eléctricos fuera de su cuerpo en su entorno externo, lo que permite un aislamiento fácil. Este artículo proporciona toda la información necesaria para generar, purificar y cuantificar estos CV C. elegans secretados ambientalmente, incluyendo cómo trabajar cuantitativamente con poblaciones muy grandes de gusanos sincronizados por la edad, vehículos eléctricos purificadores y un protocolo de citometría de flujo que mide directamente el número de vehículos eléctricos intactos en la muestra purificada. Por lo tanto, la gran biblioteca de reactivos genéticos disponibles para la investigación de C. elegans se puede aprovechar para investigar los impactos de las vías genéticas y los procesos fisiológicos en la composición de la carga EV.

Introduction

La secreción de vesículas extracelulares unidas a membrana (EV) facilita los procesos fisiológicos globales mediante el transporte activo de proteínas específicas, ácido nucleico, metabolito y cargas lipídicas entre las células1. Las células secretan vehículos eléctricos que abarcan un continuo de tamaños que van desde 2 m o más a tan pequeños como 20 nm2. Pequeños vehículos eléctricos (<200 nm) son cada vez más estudiados debido a su implicación en los procesos patológicos, incluyendo trastornos metabólicos, cáncer, enfermedades cardiovasculares, y enfermedades neurodegenerativas3,4,5. Estas patologías también han demostrado influir en la composición proteica y genética de los vehículos eléctricos de pequeños vehículos eléctricos. Por lo tanto, las firmas de biomarcadores de la patología se están descubriendo cada vez más a través de métodos de descubrimiento de carga EV como LC-MS-MS y RNAseq6,7,8,9.

C. elegans ha sido un modelo invertebrado útil para identificar vías de señalización EV evolutivamente conservadas. Por ejemplo, se demostró por primera vez que una c. elegans flippasa induce la biogénesis EV en embriones C. elegans, y se demostró que el homólogo humano influye en la liberación de EV en células humanas10,11. C. elegans EVs fueron reportados para llevar señales de erizo necesarias para el desarrollo de la cutícula. Se demostró que la entrega de erizos y otros morógenos desempeña bacote un importante papel de desarrollo de los vehículos eléctricos, y se conserva en peces cebra, ratones y humanos12,,13,,14,,15. C. elegans es muy adecuado para el descubrimiento de biomarcadores EV porque secreta vehículos eléctricos fuera de su cuerpo que funcionan en la comunicación de animales a animales16,,17 (Figura 1A). Sin embargo, la metodología establecida a través de un estudio anterior no puede utilizarse porque la fuente de alimento E. coli de los nematodos también secreta los vehículos eléctricos18. En este método, la mayor parte de la muestra se compone de contaminación por E. coli, limitando el poder de los enfoques proteómicos o RNAseq para el descubrimiento de cargas EV de C. elegans. Los métodos descritos aquí fueron desarrollados para producir CV C. elegans altamente puros a niveles de abundancia característicos de los experimentos típicos de cultivo celular y así facilitar enfoques de omics para el descubrimiento de biomarcadores EV.

Se necesitan grandes poblaciones de gusanos para generar un número suficiente de vehículos eléctricos para el análisis de carga. Por lo tanto, también se incluyen métodos para llevar a cabo el cultivo cuantitativo de grandes poblaciones de C. elegans sincronizados con el desarrollo. Normalmente, cuando se necesita un gran número de gusanos para experimentos, se cultivan en medios líquidos. Si bien esto es eficaz para generar grandes poblaciones de gusanos, la fisiología de los animales es considerablemente diferente de los gusanos cultivados en condiciones estándar en placas de agar de agar de nematodos de crecimiento (NGM). Los animales cultivados en líquido crecen más lentamente, son más delgados, muestran heterogeneidad del desarrollo y están sometidos a un alto grado de variabilidad de lotes. Por lo tanto, presentamos un medio simple pero eficaz para el cultivo cuantitativo de grandes poblaciones de C. elegans sincronizados con el desarrollo utilizando placas de crecimiento de 10 cm de altura. La composición de medios de placas de alto crecimiento incluye más peptona que las placas NGM normales y se sembran con la cepa De. coli NA22 que crece más robustamente que OP50.

Los avances en la tecnología de citometría de flujo (FACS) han permitido el análisis directo de vehículos eléctricos individuales20,,21,permitiendo la cuantificación de los vehículos eléctricos sin las limitaciones inherentes en otros métodos. El trabajo previo ha demostrado que la proteína no es un proxy útil para la abundancia de vehículos eléctrico porque diferentes metodologías de purificación dan como resultado relaciones de EV a proteína significativamente diferentes22. Las fracciones EV extremadamente puras contienen relativamente poca proteína, lo que dificulta la cuantificación de muestras con geles BCA o Coomassie. El análisis occidental puede identificar diferencias relativas de proteínas individuales, pero no puede identificar cuántos vehículos eléctricos hay en la muestra. La cuantificación robusta del número EV por análisis de seguimiento de nanopartículas se ve obstaculizada por su estrecho rango de señal a ruido, la incapacidad para diferenciar entre vehículos eléctricos y agregados sólidos, y la falta de transferibilidad de métodos entre instrumentos con diferentes especificaciones23. Por lo tanto, este artículo también contiene un procedimiento citométrico de flujo generalizable para discriminar y cuantificar los vehículos eléctricos.

Protocol

1. Preparación Añadir 2 g de gelatina a 100 ml de dH2O y calentar en el microondas hasta que empiece a hervir. A continuación, revuelva y deje que se enfríe durante 20 minutos. Pasar la solución a través de un filtro de 0,22 m y dispensar en tubos estériles. Tratar las puntas de la pipeta con gelatina inmediatamente antes del uso mediante la pipeteo y la expulsión de la solución de gelatina. Las puntas tratadas se pueden usar inmediatamente o almacenarse. Corte la membrana de un filtro de tapa estéril. Humedezca un cuadrado de 20 cm de tejido de malla de nylon de 5 m y colóquelo alrededor de la parte superior de un filtro de tapa estéril. Asegúrelo con varias bandas gruesas de goma.ADVERTENCIA: Examine cuidadosamente la tela para asegurarse de que no haya pliegues. Estos hacen espacios de aire que dificultan la succión. 2. Cálculo de grandes poblaciones de gusanos (Figura 1A) Vórtice y pipeta de 10 l de la suspensión del gusano sobre una tapa de placa de cultivo de gusano o un portaobjetos de vidrio. Repita este proceso 3x. Registre el número de animales en cada gota. Ajuste la suspensión del gusano a dos animales por L. Vortex la suspensión y la pipeta nueve gotas (10 l) en un portaobjetos o una tapa de la placa. Cuente manualmente el número de animales. Registre el número de animales en cada gota. Calcule el error medio y estándar de la media (S.E.M.) como un porcentaje de cada población de gusanos. Calcular el número total de animales en cada población dividiendo el valor medio por 10 s y luego multiplicando por el volumen total de la suspensión del gusano en el L. Figura 1: Visión general de los procedimientos para generar, cuantificar y purificar los vehículos eléctricos C. elegans. (A) Esquema para contar grandes poblaciones de animales. (B) Esquema para la generación de gusanos para la cosecha de vehículos eléctricos. (C) Esquema para purificar vehículos eléctricos de C. elegans supernatent. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Cultivo de C. elegans para la purificación de EV Generar una gran población de C. elegans sincronizadosde desarrollo. Para ello, siga los pasos que se indican a continuación. Agregue un solo animal en una placa de medios de crecimiento normal de 6 cm. Incubar durante dos generaciones y luego lavar los animales en dos placas medianas de alto crecimiento. Incubar hasta que los gusanos hayan agotado la comida. Filtrar gusanos L1 con malla de nylon de 5 m preparada en el paso 1.4. Coloque la tapa del tornillo en la botella estéril, inicie el vacío y vierta los gusanos sobre el filtro. Pase el mismo volumen del medio sobre los agregados de gusano en el filtro. Cuantifique los gusanos y calcule el número total (véase el paso 2). Los gusanos recientemente hambrientos (<24 h) cultivados en una placa de alto crecimiento dan como resultado unas 80.000 larvas L1. Centrifugar las larvas L1 a 2.000 x g durante 3 min. Resuspender a 100.000 animales por ml. Coloque 50.000 animales por placa de alto crecimiento. Cultivar los animales a 20oC hasta que sean adultos gravídicos (alrededor de 72 h). Blanquear a los adultos gravid por medios estándar y permitir que los embriones eclosionen en 10 ml de solución S Basal con colesterol de 2,5 g/ml. Cuantifique las larvas L1 (ver paso 2) y luego agregue 50.000 gusanos a cada placa de alto crecimiento. Cultivar las placas a 20oC hasta que los animales sean adultos jóvenes. Prepare a C. elegans para la generación de secretos. Lave los gusanos de las placas añadiendo 15 ml de M9 estéril con carbenicilina de 50 g/ml a cada placa de alto crecimiento. Deje que las placas saturadas se sit for 5 min. Dislodge worms por la vuelta del tampón alrededor de la placa. Evite el sloshing. Vierta el tampón de cada placa en un tubo cónico separado de 50 ml. Repita el paso de lavado 2 veces más para un total de 45 ml de tampón por placa. Deje que los gusanos se conforman con 15 minutos. Decant el sobrenadante y añadir 50 mL de nuevo tampón M9 al tubo. Repita para un total de 4x. Flotar los gusanos en la parte superior de un 30% sacarosa escalone de escalón y recuperar animales en la solución S Basal24. Resuspenda brevemente los gusanos en 15 ml de naCl de 100 mM de hielo, agregue 15 ml de sacarosa 60% helada e invierta para mezclar. Con una pipeta de vidrio capa suavemente 5 mL de hielo-frío 100 mM NaCl en la parte superior de la mezcla de sacarosa. Centrífuga a 1.500 x g durante 5 min. Los gusanos se concentrarán en la interfaz entre el NaCl y la sacarosa. Pipetear suavemente los animales de la interfaz en un nuevo tubo cónico de 50 ml. Añadir solución S Basal a 50 mL. Deje que los gusanos se asienten 5 min. Decantar el sobrenadante y añadir 50 mL fresco de solución S Basal. Repita esto al menos 3veces. Cuantifique el número de gusanos como se describe en el paso 2. Resuspenda los gusanos a una densidad de un animal por L con solución estéril S Basal que contenga 2,5 g/ml de colesterol y 50 m de carbenicilina. Para preparar la muestra para la generación de secretos, agregue hasta 400 ml de la suspensión a un matraz estéril de 2 L con fondo. Colocar matraces en el rotador circular en una incubadora de 20oC a 100 rpm durante 24 h. 4. Purificación EV Cosecha y fraccionamiento Retire el matraz 2L de gusanos de la incubadora y pelee a los animales en viales cónicos de 50 ml (500 x g durante 2 min). Vierta el sobrenadante a través de un filtro de vacío de 0,22 m para eliminar los restos de partículas.NOTA: En este punto, el sobrenadante filtrado que contiene el secretomo y las vesículas se puede almacenar a -80 oC. Cuente el número de animales como se describe en el paso 2. Determinar la viabilidad de los gusanos colocando una gota de gusanos suspendidos en un césped bacteriano. Espere 15 minutos y luego anotar animales como en movimiento, paralizados o muertos. Concentrar el sobrenadante filtrado de 0,22 m a 700 l utilizando unidades de filtro regenerados de nitrocelulosa de 10 kDa. Agregue la solución basal de 150 l y luego pipetee sobre el filtro y el vórtice. Repita 2x. Centrifugar el sobrenadante concentrado a 18.000 x g durante 20 min a 4 oC y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Este paso elimina los posibles desechos o partículas más grandes que puedan haberse acumulado durante la manipulación. Añadir el cóctel inhibidor de la proteasa + EDTA según las instrucciones del fabricante.NOTA: En este punto, el sobrenadante concentrado que contiene el secretomo y las vesículas se puede almacenar a -80 oC. Cromatografía de exclusión de tamaño Vierta la resina de agarosa de 80–200 m (rango de fraccionamiento del tamaño del poro de 70.000 a 40.000.000 kDa para proteínas globulares) en un cartucho de columna de flujo de gravedad vacío. Flow S Basal solución hasta que el lecho de resina se embala a un volumen final de 10 ml.NOTA: Si se vierte demasiada resina en el cartucho de columna, disperse la parte superior de la columna y elimine el exceso con una pipeta. Pasar 40 ml de solución estéril filtrada S Basal a través de la columna y dejar que fluya bajo gravedad.ADVERTENCIA: Compruebe que la resina no esté perturbada. Deje que el búfer fluya hasta que la parte superior de la resina no esté sumergida y luego cubra la parte inferior del cartucho de columna. Coloque un tubo de recogida debajo de la columna. Retire la tapa colocada en el cartucho. Agregue el secretome concentrado obtenido en el paso 2.1 en sentido agotante a la parte superior del lecho de columna. Pipeta 1 mL de solución S Basal en sentido de gota. Coloque un tubo de recogida nuevo debajo de la columna. Llenar lentamente el depósito de la columna superior con una solución basal de 5 ml para no perturbar la resina. Recoger los primeros 2 ml de eluido y luego cambiar rápidamente los tubos y recoger los siguientes 4 mL. Esta es la fracción que se enriquece para los vehículos eléctricos. Concentre el eluido a 300 ml con un filtro de nitrocelulosa regenerada de 10 kDa cortado en peso molecular (MWCO) y el retentado de transferencia a un tubo de microcentrífuga de baja unión. Lave la membrana del filtro 2x con 100 l de solución S Basal por vórtice durante 20 s y pipeteando el tampón a través del filtro. Añadir a la muestra inicial para un volumen final de 500 l. Añadir cóctel inhibidor de proteasa según las instrucciones del fabricante. Realice los experimentos aguas abajo inmediatamente (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, etc.) o almacene a -80 oC. 5. Cuantificación de la citometría de flujo de la abundancia EV Preparación del tinte Prepare un stock de 10 mM de DI-8-ANEPPS usando DMSO fresco. Distribuir en alícuotas de 10 ol y almacenar a -20 oC. Preparar una solución de trabajo de 1 mM añadiendo 90 ml de PBS filtrado estéril a un tubo con 10 ml de material de tinte. Preparación experimental de muestras Añadir 840 l de solución S Basal en un tubo de microcentrífuga. A continuación, agregue 60 l de los vehículos eléctricos purificados generados en la sección 4.2 y el vórtice. Alícuota 300 l de la muestra en dos nuevos tubos de microcentrífuga. Ahora hay un conjunto experimental de tres tubos que contienen 300 l de vehículos eléctricos diluidos cada uno. Etiquetar los tubos #1–3. Para tomar muestras #2 y #3 añadir 7 l de la acción DI-8-ANEPPS preparada en 5.1.2. A continuación, agregue 7 l de 1% de Tritón-X 100 al tubo #3. Mezclar cada tubo por vórtice. La muestra de Sonicar #3 colocando la punta del sonicador en el medio de la muestra y pulsando 10 veces a un ciclo de trabajo del 20% de potencia del 30%.ADVERTENCIA: Asegúrese de que la punta de la sonda del sonicador esté en el centro de la muestra para que la generación de espuma se mantenga al mínimo. La espuma puede comprometer la muestra haciendo que los vehículos eléctricos se acusen. Añadir 300 l de solución S Basal a dos tubos de microcentrífuga. Añadir 7 l del reactivo de trabajo DI-8-ANNEPS preparado en el paso 5.1 al segundo tubo y etiqueta “Dye Only”. Etiquete el otro tubo “Solo búfer”.NOTA: Prepare las muestras de control Solo tinte y Solo zona de influencia y las muestras experimentales con la misma fuente S Basal. Incubar las muestras lejos de la luz directa y a temperatura ambiente durante 1 h. Llevar a cabo experimentos FACS. Ajuste el filtro de excitación FACS a 488 nm (azul) y el filtro de emisión a 605 nm (naranja). Establezca el caudal en 1,5 s por minuto. Ejecute la mezcla de calibración FACS nanopera (opcional pero recomendada). Ejecute cada muestra en una máquina FACS durante 3 min (180 s). Tenga en cuenta los tiempos de ejecución exactos en segundos. Analice los datos FACS. Abra los archivos con el software de análisis FACS. Cambie el eje Y a 488-Org (área) haciendo clic en el Eje, seleccionando en el menú desplegable. Establezca una puerta rectangular que comience en la parte superior de la parcela, que abarca desde el nivel SALS 102 hasta 104 (partículas de tamaño<300 nm). Extienda la puerta hacia abajo hasta que contenga el 2,5% del total de eventos. Asigne a la puerta el nombre "DI-8-ANEPPS+". Cuantificación de la abundancia de muestra sEV Copie esta puerta y péguela en las otras dos muestras del conjunto experimental, así como en los controles Solo búfer y Solo tinte. Exporte el análisis a una hoja de cálculo. Si las muestras FACS no se ejecutaron durante los 3 min (180 s) recomendados, normalice todos los recuentos de eventos de la muestra a eventos por 180 s. Por ejemplo, si se ejecutó una muestra durante 250 s, el número de evento DI-8-ANEPPS+ se escala en 250 s/180 s. Elimine los eventos de fondo de tinte restando el número de eventos DI-8-ANEPPS+ en el control Dye Only de los de la #2 de muestra. Elimine los eventos de fondo de isotipo restando el número de eventos DI-8-ANEPPS+ en #1 de ejemplo. Elimine los eventos que no insensibles al detergente restando el número de eventos DI-8-ANEPPS+ en #3 de muestra. Este valor es el número de vehículos eléctricos de buena fe. Calcule el número de vehículos eléctricos en 1 l de muestra dividiendo el valor calculado en el paso 5.5.5 por el volumen analizado en el valor (4,5 l analizado como se describe en el paso 5.3) y multiplique por el factor de dilución (10x como se describe en el paso 2.5). Multiplique este valor por el número de l restantes en la preparación de EV. Este es el número de vehículos eléctricos disponibles para el análisis descendente. Figura 2: Esquema de preparación de muestras de citometría de flujo para cuantificar la abundancia de EV. (A) La preparación del vehículo eléctrico se divide en tres muestras idénticas. La muestra n.o 1 es el control negativo Sin tinte. A continuación, se añade DI-8-ANEPPS a las muestras #2 y #3. A continuación, se agrega Triton-X 100 a la #3 de muestra. La flecha verde indica que sólo #3 de muestra se sonica posteriormente. Los datos del flujo ayudan a determinar el número absoluto de vehículos eléctricos sensibles al detergente en las muestras de FACS y luego calculan la abundancia de vehículos eléctricos en la preparación total. La puerta para determinar los eventos con tinte positivo se establece con #1 de muestra, que no contiene tinte. La escritura roja en los datos de la hoja de cálculo es para ilustrar que los eventos de colorante positivo de la muestra tratada con detergente se restan de la muestra con tinte. (B) Ecuaciones para cuantificar vehículos eléctricos en una muestra analizada por FACS y calcular el número total de vehículos eléctricos en la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

En la Figura 1se muestra un esquema para los procesos necesarios para generar y purificar vehículos eléctricos. Los tiempos típicos necesarios para completar cada paso se muestran debajo. La Figura 2 muestra un esquema para preparar muestras para el análisis FACS utilizando DI-8-ANEPPS(Figura 2A),así como los cálculos necesarios para estimar el número total de vehículos eléctricos en una muestra(Figura 2B). Los resultados representativos de 10 réplicas biológicas se muestran en la Figura 3A. La variabilidad entre réplicas no es significativa y el Típico S.E.M. de tamaño de la población es un poco más del 10%(Figura 3B). Filtrar los gusanos y cultivar en las placas frescas de alto crecimiento generará una gran población de adultos gravídicos adecuados para la sincronización de lejía. Una sola placa hambrienta procesada de esta manera puede producir una población experimental de 1 x 106 o más progenie sincronizada porque cada adulto gravid contendrá alrededor de 10 huevos. Es posible mantener grandes poblaciones de poblaciones sincronizadas con el desarrollo filtrando huevos y larvas a través de un filtro de 40 m para obtener vehículos eléctricos de animales mayores. Los adultos retenidos son transferidos a nuevas placas de alto crecimiento a una densidad de 20.000 animales por placa. Este proceso se repetía cada 2 días. La Figura 3C muestra tres réplicas biológicas de las poblaciones de gusanos que se mueven a través de tres transferencias de placas. La transferencia de animales entre placas da lugar a una pérdida de animales de aproximadamente un 10%(Figura 3C),mientras que alrededor del 20% de los animales se pierden en el paso de flotación de la sacarosa(Figura 3D). Figura 3: Cuantificación de grandes poblaciones de C. elegans para el análisis de EV. (A) Una comparación del número de gusanos de etapa larval L1 aislados de una sola placa de crecimiento alto recientemente hambrienta (<24 h). Se trazan los valores de cada una de las 10 réplicas biológicas. La suma de todos los puntos de datos en las 10 réplicas también se presenta como una trama de violín y barra con S.E.M. Esto muestra que una sola placa de gusanos recientemente hambrientos producirá 80.000 gusanos de etapa larval L1. (B) El S.E.M. de las 15 mediciones diferentes de la población de placas en el panel A trazadas como puntos individuales. Generalmente, el S.E.M. es ligeramente superior al 10%. (C) Se estimaron tres réplicas biológicas de las poblaciones de gusanos después de cada una de las dos transferencias entre placas cada 4 h. Esta transferencia de animales entre placas no resultó en una disminución significativa en el tamaño de la población. Esto indica que la metodología presentada aquí para mover gusanos no da lugar a una pérdida significativa de animales. (D) Mediciones de población tomadas a lo largo de tres réplicas experimentales de EV: el número de animales que se estimaron para las larvas L1 originales que iniciaron el experimento, el número de animales adultos jóvenes recuperados de la flotadente de sacarosa y listos para el período de incubación de 24 horas, el número de animales contados a partir de la preparación del EV tras la recuperación del secretome. Hay una pequeña pero no significativa disminución del tamaño de la población entre la estimación inicial de la población en la etapa larval L1 y más tarde cuando los animales son adultos jóvenes. La medición media de la población L1 fue designada como 100% y todas las demás mediciones se escalaron por su relación con este valor. Barras de error S.E.M. * – valor p < 0.05, N.S. – no significativo en una prueba t emparejada paramétrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La relación proteína-animal es una métrica útil para caracterizar una preparación de EV. Esta métrica puede proporcionar un medio rápido para determinar la consistencia entre las preparaciones ev. En promedio, 1.000 animales adultos jóvenes de tipo salvaje secretan 1 g de proteínas de más de 10 kDa en su entorno(Figura 4A). Cuando esta fracción se separa aún más por la cromatografía de exclusión de tamaño, el perfil de elución total de proteínas muestra un pequeño pico de proteína entre 2-6 ml y un pico grande después de 8 ml. Los vehículos eléctricos están contenidos en los primeros 5 ml del eluido de columna(Figura 4B). Análisis de seguimiento de nanopartículas los primeros 5 ml del eluido de columna contiene una población monodispersa de vehículos eléctricos pequeños de 150 nm(Figura 4C). La microscopía electrónica de transmisión de fracciones de exclusión de tamaño revela abundantes vehículos eléctricos en la fracción de eluido de 2-6 ml de eluido, pero no en los volúmenes de eluido posteriores. Los vehículos eléctricos son conocidos por su forma similar a una copa y, por lo tanto, son fáciles de discriminar de las partículas sólidas que aparecen como puntos brillantes punctadas cuando se preparan bajo las condiciones de tinción negativas(Figura 4D). Figura 4: Purificación de Cv C. elegans a partir de biomasa total secretada. (A) Se trazó la relación entre las proteínas totales superiores a 10 kDa y el número de gusanos incubados en la preparación de 10 réplicas biológicas. La mayoría de las preparaciones contenían 1 g de proteína por cada 1.000 animales. (B) Perfil de elución proteica de una columna de resina de 10 ml cargada con 1 ml del secretome concentrado. Las fracciones que se consolidan en análisis posteriores se sombrean en grupos. (C) Análisis de seguimiento de nanopartículas de las fracciones elutadas de resina consolidada de 2 a 6 ml. El intervalo de confianza del 95% está sombreado en gris. (D) Análisis TEM de las fracciones elatadas de resina consolidada. El material de partida tenía partículas similares a vesículas y partículas no vesículas. La fracción de elución consolidada de 2-6 ml se enriquecizó para vesículas con pocas partículas no vesículas. Las fracciones consolidadas de 7-11 ml contenían pocas partículas similares a vesículas, pero muchas partículas no vesículas. Las fracciones de elución de 12-15 ml contenían sólo partículas no vesículas. Todas las micrografías se muestran con el mismo aumento. Barra de escala a 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Para comparar directamente las características de la citometría de flujo entre C. elegans y los vehículos eléctricos humanos, purificamos los vehículos eléctricos a partir de los medios acondicionados de los cultivos celulares de las neuronas humanas con este método. La citometría de flujo separa las partículas en función de la dispersión de la luz. La dispersión de luz de ángulo pequeño (SALS) se correlaciona aproximadamente con el tamaño, y la dispersión de luz de ángulo largo (LALS) se correlaciona con la estructura de la membrana interna. La mayoría de los eventos de muestra totales tanto del cultivo celular como de las preparaciones de C. elegans EV están estrechamente enfocados en un clúster centrado alrededor de 103 SALS y 104 LALS(Figura 5A). Un histograma de eventos de muestra de C. elegans EV ordenados por SALS muestra que todos los preparativos alcanzan un máximo de 103 (Figura 5B). Figura 5: Los vehículos eléctricos C. elegans están claramente definidos por sus propiedades de dispersión de luz. (A) Histograma de eventos SALS en tres réplicas biológicas de C. elegans EV. El 80 % del total de los eventos de la muestra se encuentran dentro de una población estrecha y claramente definida. Al igual que el análisis de seguimiento de nanopartículas, muestra que la distribución de tamaño de los vehículos eléctricos C. elegans es monodispersa. El histograma del búfer S Basal utilizado para diluir las muestras se muestra para la comparación. (B) Comparación de las propiedades refractivas de C. elegans y los vehículos de cultivo de células humanas purificados con los métodos descritos en este texto. Ambos tipos de EV presentan consistentemente distribuciones comparables de dispersión de luz corta y de ángulo largo (SALS y LALS). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. El DI-8-ANEPPS etiqueta robustamente a los vehículos eléctricos C. elegans, destacando constantemente la mayoría de los eventos totales tanto en las muestras derivadas de C. elegans como en las de cultivo celular. Las perlas y controles de calibración se presentan en la Figura 6A. Las parcelas de dispersión FACS individuales se muestran a partir de una muestra de C. elegans preparada a partir de 200.000 animales (#1) y dos preparadas a partir de 500.000 animales(Figura 6B). También se analizaron los vehículos eléctricos de 100 ml (#1) o 200 ml (#2,3) del cultivo celular(Figura 6C). Tanto c. elegans como muestras derivadas del cultivo celular mostraron abundantes eventos fluorescentes que desaparecieron cuando se trataron con 0.05% Tritón-X 100 y sonicación de luz. Esto demuestra que los eventos etiquetados son estructuras de fosfolípidos lábiles detergentes (vesículas) en lugar de agregados de lipoproteínas sólidas insensibles al detergente. La abundancia EV se calcula como la diferencia entre el número de eventos en la puerta DI-8-ANEPPS+ entre las fracciones sin detergente (-) y con detergente (+) menos los eventos en el control Dye Only. Para mayor claridad, los datos presentados individualmente en la Figura 6B y la Figura 6C se resumen como gráficos de barras en la Figura 6D y la Figura 6E. La abundancia de los vehículos eléctricos purificados no era significativamente diferente entre los C. elegans y los preparados derivados del cultivo celular(Figura 6F). Figura 6: Ejemplos de datos de citometría de flujo utilizados para calcular la abundancia ev. (A) Para asegurarse de que el número de eventos se puede comparar directamente entre muestras, los controles Buffer Only y Buffer y Dye Only deben ejecutarse al mismo caudal y tiempo de recolección que las fracciones de muestra EV. Hay muy pocos eventos en la puerta DI-8-ANEPPS. (B) Resultados representativos del protocolo de tratamiento DI-8-ANEPPS y detergente de C. elegans. Se muestran tres réplicas biológicas. Se prepararon #1 de réplicabiológica biológica a partir de 200.000 animales, mientras que #2 y #3 se prepararon a partir de 500.000 animales. La desaparición de los vehículos eléctricos con el tratamiento detergente es evidente en todos los casos. (C) Resultados representativos del protocolo de tratamiento DI-8-ANEPPS y detergente utilizando medios acondicionados de cultivo celular humano. Se prepararon réplicas biológicas #1 y #2 a partir de 200 ml de medios acondicionados, mientras que las réplicas biológicas #3 se prepararon a partir de 100 ml. (D) Gráfico de barras de los datos recogidos de las tres réplicas biológicas de los vehículos eléctricos C. elegans. Barras de error: S.E.M. Pruebas t de dos colas emparejadas entre tratamientos. Valor p < 0,001. (E) Gráfico de barras de los datos recopilados de las tres réplicas biológicas de los vehículos eléctricos derivados del cultivo celular. Pruebas t de dos colas emparejadas entre tratamientos. Valor p < 0,001 (F) Se calculó el número de eventos sensibles al detergente con etiqueta de tinte por l para todas las réplicas biológicas de C. elegans y el cultivo celular. Los valores entre las dos fuentes de muestra EV no son significativamente diferentes. Pruebas t de dos colas emparejadas entre los tratamientos p valor a 0,685. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. La Tabla 1 contiene los valores experimentales sin procesar para el valor completo de 4,5 ml de cada tipo de muestra analizado. El número total de eventos recogidos de las fracciones EV purificadas de 500.000 animales fue de 10 a 20 veces sobre el número de fondo de partículas recogidas solo por tampón, mientras que la fracción purificada de 200.000 animales contenía alrededor de 2 veces más eventos como tampón solo. El número de eventos dentro de la puerta DI-8-ANEPPS+ también se muestra para cada muestra. Estas métricas se pueden importar a una hoja de cálculo para calcular el número de vehículos eléctricos sensibles al detergente y con tinte según se describe anteriormente. Por ejemplo, el número de vehículos eléctricos en 1 ml de la primera réplica biológica de C. elegans mostrada se calcularía de la siguiente manera: (18.974 – 3.853 – 1.487) x (10/4.5) x 1.000 a 30.297.778. Tabla 1: Datos tabulados de citometría de flujo. Los datos que se muestran en la Figura 6 se presentan como una hoja de cálculo. Para cada muestra se muestran los eventos totales y los eventos bloqueados DI-8-ANEPPS+. Cada réplica biológica está dispuesta en el orden de las muestras #1-3 en el protocolo. Estas métricas revelan que el número total de eventos recogidos de las muestras de C. elegans preparadas a partir de 500.000 animales o 200 ml de medios acondicionados de cultivo celular fue de 10 a 20 veces sobre el número de fondo de partículas recogidas solo por tampón, mientras que la réplica biológica purificada de 200.000 animales contenía alrededor de 2 veces más eventos totales como tampón solo. El número de eventos dentro de la puerta DI-8-ANEPPS+ también se muestra para cada muestra. Estas métricas se pueden exportar a una hoja de cálculo para calcular el número total de vehículos eléctricos. Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).

Discussion

Un desafío fundamental del campo EV es separar la amplia variedad de subtipos EV2. Los métodos descritos aquí utilizan filtración, centrifugación diferencial y cromatografía de exclusión de tamaño para generar una población pura de pequeños vehículos eléctricos porque anteriormente se demostró que los vehículos eléctricos de 100 nm estaban secretados en el entorno externo y funcionan en vías de comunicación fisiológicamente relevantes16. Los vehículos eléctricos purificados mediante cromatografía de exclusión de tamaño pueden seguir siendo una mezcla de exosomas y microvesículas pequeñas porque estas subclases EV tienen un tamaño similar. Las subclases vertebradas EV se separan comúnmente por inmunoprecipitación porque este método aísla los vehículos eléctricos a través de la unión a marcadores selectivos de proteínas de membrana. Los métodos descritos facilitan la identificación de las proteínas marcadoras de membrana C. elegans EV. Por lo tanto, en el futuro puede ser posible separar aún más las subclases de EV pequeñas a través de métodos de inmunoprecipitación análogos. En teoría, la inmunoprecipitación podría aislar los vehículos eléctricos de los gusanos bien alimentados porque los vehículos eléctricos de E. coli no deben interactuar con el anticuerpo. Los investigadores interesados en identificar las cargas proteicas y genéticas de las subclases de EV más grandes (>200 nm) pueden hacerlo omitiendo el paso de filtración de 0,22 m y luego analizando el pellet en lugar del sobrenadante. Descubrir las abundancias de proteínas y cargas genéticas de grandes vehículos eléctricos establecerá una comprensión más completa de los procesos fisiológicos que funcionan a través del secreto de C. elegans. Además de ser secretados en el medio ambiente, los vehículos eléctricos C. elegans se transfieren internamente entre los tejidos. Por lo tanto, estos métodos solo aíslan un subconjunto del total de CV de C. elegans. Sin embargo, el descubrimiento de carga de vehículos eléctricos internos no es posible porque no hay ningún método para separar los vehículos eléctricos de los gusanos lysed. El análisis de carga de este subconjunto de EV secretado externamente proporciona un medio para identificar posibles marcadores generales de proteína EV capaces de etiquetar los vehículos eléctricos internos también.

La escala de la preparación del EV dependerá de las demandas del experimento. Un total de 500.000 adultos jóvenes proporciona suficientes vehículos eléctricos para realizar análisis de citometría de flujo, LC-MS-MS y RNAseq en paralelo. Este número se puede escalar hacia arriba o hacia abajo dependiendo de las necesidades experimentales. El mayor factor práctico para escalar es el número de placas de crecimiento de 10 cm de altura requeridas. Las placas de alto crecimiento preparadas con 500 s de 20x concentrado sin pernoctación del cultivo NA22 apoyarán a una población de 50.000 adultos desde la etapa larval L1 hasta el primer día de la edad adulta. Por lo tanto, para llevar a cabo un experimento con 500.000 adultos, se necesitan 13 placas de alto crecimiento: una placa para generar la población de L1s, dos placas para generar los adultos para el blanqueo, y 10 placas para el crecimiento de los animales experimentales. Estas métricas están supeditadas a las condiciones de sembrado y crecimiento bacteriano de las placas de alto crecimiento. Por lo tanto, se recomienda hacer todas las placas de una manera estandarizada y luego calibrar con cantidades conocidas de animales.

Los gusanos se cuentan en dos etapas durante el proceso de cultivo: 1) antes de sembrar gusanos en placas y 2) antes de generar los medios acondicionados. Se ha demostrado que la densidad de cultivo de animales afecta el comportamiento, el desarrollo y las respuestas de estrés15,,16,,17,,18 y, por lo tanto, también puede influir en las cargas EV. Por lo tanto, para una densidad de cultivo consistente es necesario estimar con precisión las poblaciones de gusanos. La cuantificación del número de gusanos en nueve gotas da confianza estadística a las estimaciones de la población. Es esencial tratar cada gota individualmente, vórtice entre cada gota e insertando la pipeta a la misma distancia en la suspensión del gusano. Tomar estas precauciones garantizará valores de S.E.M. del 5-10% de la población total. Si el S.E.M. para una población de gusanos es superior al 20%, entonces algo salió mal.

Después del período de incubación libre de bacterias de 24 horas, los jóvenes y salvajes tipo C. elegans se arrastran inmediatamente después de la adición a un césped bacteriano. Esto indica que la incubación no afecta gravemente su salud. Sin embargo, este paso influye en la fisiología de los animales y por lo tanto puede influir en la composición de las cargas EV. Por lo tanto, cuando se trabaja con genotipos muy enfermos o animales mayores, es esencial comprobar la viabilidad después del paso de incubación. Si todos los animales no sobreviven a la incubación, entonces aumente el tamaño de la población experimental y disminuya el tiempo de incubación. Cuando se trabaja con grandes volúmenes de medios acondicionados, es más práctico utilizar un concentrador de células agitadas con un filtro hecho de nitrocelulosa regenerada. Los vehículos eléctricos no se unen a esta química de filtro tan fuertemente como otros tipos de filtro14.

La proporción de la proteína total recuperada de los medios acondicionados con el número de animales incubados para realizar la preparación es una métrica útil. Si esta proporción es mucho mayor de lo esperado, entonces es posible que las estimaciones de población estuvieran apagadas o que los animales murieran y se deterioraran en los medios condicionados. Si esta proporción es mucho menor de lo esperado, entonces alguna proteína puede haberse perdido en los filtros durante el proceso de concentración. Si bien los métodos FACS cuantificarán directamente los vehículos eléctricos en la preparación, esta métrica es útil porque puede resaltar las anomalías de la muestra al principio del proceso. Otro método útil para verificar la calidad de la preparación de EV es la microscopía electrónica de transmisión, como se muestra en la Figura 4D. Aunque el protocolo para la microscopía electrónica de transmisión no se incluye formalmente en este artículo de métodos debido a la longitud, se puede llevar a cabo por métodos estándar. Se recomienda realizar este tipo de análisis, al menos inicialmente, como método complementario a FACS para evaluar la calidad de las preparaciones de EV. Para obtener mejores resultados, utilice rejillas de formvar-carbono recién descargadas y manchar las muestras con un 2% de ácido fosfotúltico en lugar de acetato de urilo.

DI-8-ANEPPS fue elegido porque se ha demostrado que etiqueta cuantitativamente las membranas EV, superando a otros colorantes EV generales con muestras de biopsia humana y liposomas25. Las mediciones son rápidas, tomando sólo 3 minutos de tiempo de recolección para cada muestra. La cuantificación de vehículos eléctricos sensibles al detergente tiene un significado funcional directo porque aprovecha una distinción física fundamental entre los vehículos eléctricos y los agregados de lipoproteínas sólidas. Es importante destacar que este método no está influenciado por la cantidad de proteína total o el número de agregados no EV y, por lo tanto, puede cuantificar los vehículos eléctricos obtenidos a través de diferentes métodos de purificación de manera imparcial. La métrica EV verificada por FACS que describimos aquí sería especialmente útil para estudios que demuestran los impactos fisiológicos de los vehículos eléctricos purificados. También podría beneficiar al campo EV en general establecer una metodología FACS como una métrica universal para que las abundancias absolutas de vehículos eléctrico puedan compararse directamente entre los estudios. Los colorantes vitales también pueden etiquetar Los vehículos eléctricos C. elegans, pero no son tan brillantes como los vehículos eléctricos etiquetados con Di-8-ANEPPS.

Este enfoque de purificación aprovecha la secreción activa de vehículos eléctricos fuera de los cuerpos de gusanos vivos intactos. Esto permite que los vehículos eléctricos C. elegans se aíslen a una pureza y abundancia comparables a partir del cultivo celular, especificaciones que son suficientes para identificar cientos de cargas de proteínas y ARN a través del análisis LC-MS-MS y RNAseq26. Por lo tanto, la gran biblioteca de reactivos disponibles para la investigación de C. elegans se puede aprovechar para investigar la influencia de la perturbación genética y fisiológica en la composición de la carga EV.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Nick Terzopoulos por sus placas de gusano y reactivos; el Centro de Genética de la Caenorhabditis (CGC) en la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440) para la línea de nematodos N2; Lucia Vojtech, PhD, para asistencia con el análisis de seguimiento de nanopartículas; Jessica Young, PhD, y Marie Claire, MD, PhD, para medios celulares condicionados neuronales derivados de hiPSC; Wai Pang para obtener ayuda con las imágenes TEM. Este trabajo fue apoyado por la concesión de NIH P30AG013280 a MK y NIH subvención AG054098 a JCR.

Materials

0.22 filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05 % to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2-liter bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms
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Riferimenti

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Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).
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