細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

1. 準備 ゼラチン2gを100mLのdH2Oに加え、沸騰し始めるまで電子レンジで加熱します。その後、かき混ぜて20分間冷まします。 0.22 μmフィルターを通して溶液を渡し、滅菌チューブに分配します。使用の直前にゼラチンを使用してピペットチップを治療し、ゼラチン溶液を排出します。処理されたヒントは、すぐに使用するか、保存することができます。 無菌キャップフィルターから膜を切り取ります。 5 μmナイロンメッシュ生地の20 cmの正方形を濡らし、滅菌キャップフィルターの上部の周りに置きます。いくつかの厚いゴムバンドでそれを固定します。注意: 折り目がないことを確認するために、慎重に生地を調べます。これらは吸引を妨げる空気ギャップを作る。 2. ワームの集団を大量に計算する(図1A) ウォーム懸濁液のボルテックスおよびピペット10μLを、ワーム栽培プレート蓋またはガラススライド上に取り付ける。このプロセスを 3x を繰り返します。各ドロップ内の動物の数を記録します。 1 μLあたり2匹の動物にワームサスペンションを調整します。 スライドまたはプレートの蓋に懸濁液とピペット9滴(10μL)を渦。手動で動物の数を数えます。各ドロップ内の動物の数を記録します。 各ワームの母集団に対する割合として、平均値(S.E.M.)の平均誤差と標準誤差を計算します。 各集団の動物の総数を計算するには、平均値を10 μLで割り、μLでワーム懸濁液の総量を掛けます。 図1:C.エレガンスEVの生成、定量、精製のための手順の概要(A) 動物の集団を多く数える略図。(B) EV の収穫のためのワーム生成の概略図。(C) C.エレガンススーパーナテントからのEVを浄化するための回路図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 3. EV精製のためのC.エレガンスの育成 発達的に同期したC.エレガンスの大規模な人口を生成します。これを行うには、次の手順に従います。 6 cmの正常な成長媒体の版の単一の動物を加える。2世代のインキュベートし、2つの高成長培地プレートに動物を洗浄します。 ワームが食物を使い果たすまでインキュベートする。 ステップ1.4で調製した5 μmナイロンメッシュを用いたフィルターL1ワーム。滅菌ボトルにスクリューキャップを置き、真空を開始し、フィルターの上にワームを注ぎます。フィルタ上のワーム集約上で、同じメディアのボリュームを渡します。 ワームを定量化し、合計数を計算します(手順 2 を参照)。最近、飢えた(<24 h)ワームが高成長プレート上で増殖し、約80,000匹のL1幼虫が生じる。 遠心分離機L1幼虫は2,000xggで3分間、1mLあたり約10万匹の動物に再中断する。 高成長プレートあたり〜50,000匹の動物を配置します。彼らはグラビド大人になるまで20°Cで動物を栽培(約72時間)。 標準的な手段でグラビッド成人を漂白し、胚が2.5 μg/mLコレステロールでS基底溶液の10 mLで孵化することを可能にする。 L1幼虫を定量化し(ステップ2を参照)、各高成長プレートに50,000個のワームを追加します。 動物が若年成人になるまで20°Cでプレートを栽培する。 セプチオム世代のためにC.エレガンスを準備します。 50 μg/mL カルベニシリンを用いた 15 mL の無菌 M9 を各高成長プレートに加えて、プレートからワームを洗浄します。飽和プレートを5分間座らせます。スロッシングは避けてください。各プレートから別の 50 mL 円錐管にバッファーを注ぎます。洗浄ステップを2倍にして、プレート当たり合計45mLのバッファーを繰り返します。 ワームは15分間落ち着き、上清をデカントし、50 mLの新鮮なM9バッファーをチューブに加えます。合計 4 倍の操作を繰り返します。 30%ショ糖ステップ勾配の上にワームを浮かべ、S基底溶液24で動物を回復する。 15 mLの氷冷100mM NaClでワームを一時的に再中断し、15 mLの氷冷60%スクロースを加え、反転して混合します。ガラスピペットを使用すると、スクロース混合物の上部に氷冷100 mM NaClの5 mLを穏やかに重ねます。 1,500 x gで 5 分間の遠心分離機 は、NaCl とスクロースの間のインターフェイスに集中します。 新しい50 mL円錐形の管にインターフェイスから動物を静かにピペット。S基底溶液を50 mLに追加します。ワームが5分を落ち着かせる。 上清をデカントし、S基底溶液の新鮮な50 mLを追加します。これを少なくとも3倍繰り返します。 ステップ 2 で説明したとおりに、ワームの数を定量化します。 コレステロール2.5μg/mLと50μMのカルベニシリンを含む滅菌S基底溶液を用いて、1μL当たり1匹の動物の密度にワームを再懸濁します。 分泌物の生成のためにサンプルを準備するには、滅菌2 L底バッフルフラスコに懸濁液の最大400 mLを追加します。 20°Cインキュベーターで200rpmで24時間、円形の回転子にフラスコを置きます。 4. EV精製 収穫と分画 インキュベーターから2Lフラスコを取り出し、動物を50mLの円錐バイアル(500 x g2分間)でペレットします。 0.22 μm真空フィルターを通して上澄みを注ぎ、粒子状の破片を取り除きます。注:この時点で、分泌物と小胞を含む濾過上清は-80°Cで保存することができます。 ステップ2で説明した動物の数を数える。 細菌の芝生に懸濁されたワームの一滴を置くことによって、ワームの生存率を決定します。15分待ってから、動いたり、麻痺したり、死んだりして動物を得点します。 再生ニトロセルロース10 kDaフィルタユニットを使用して、0.22 μmの濾過上清を700 μLに濃縮します。150 μL S 基底溶液を加え、フィルターと渦の上にピペットを加えます。2x を繰り返します。 4°Cで20分間18,000xgで濃縮上 g清を遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。この手順により、取り扱い中に蓄積された可能性のある破片や大きなパーティクルが除去されます。 プロテアーゼ阻害剤カクテル+EDTAをメーカーの指示に従って追加します。注:この時点で、分泌液と小胞を含む濃縮上清は-80°Cで保存することができます。 サイズ除外クロマトグラフィー 80~200 μm のアガロース樹脂(球状タンパク質用の孔径分画範囲70,000 ~40,000,000 kDa)を空の重力流カラムカートリッジに注ぎます。フローS基底液は、樹脂のベッドが10 mLの最終容積で詰まるまで。注:列カートリッジに樹脂を注ぎ過ぎる場合は、カラムの上部を分散させ、ピペットで余分なものを取り除きます。 40 mLの無菌濾過S基底溶液をカラムを通して通過させ、重力下で流れさせます。注意: 樹脂が乱れていないことを確認してください。 樹脂の上部が水没しないまでバッファを流し、カラムカートリッジの底部にキャップします。柱の下にコレクション チューブを配置します。 カートリッジに付けたキャップを取り外します。ステップ2.1で得られた濃縮分泌物をカラムベッドの上部に滴下して追加します。ピペット1 mLのS基底溶液ドロップワイズ。カラムの下に新鮮なコレクションチューブを置きます。 樹脂を乱さないため、上部カラムのリザーバに5 mL S基底液をゆっくりと充填します。溶出液の最初の2 mLを収集し、すぐにチューブを変更し、次の4 mLを収集します。これは、EV 用に付加される分数です。 再生したニトロセルロース10kDa分子量を遮断した(MWCO)フィルターで溶離液を300μLに濃縮し、低結合マイクロ遠心分離管にリテンテートを移管する。 S基底溶液100 μLでフィルター膜2xを洗浄し、20 sのボルテックスを行い、フィルター全体にバッファーをピペット処理します。最終ボリューム 500 μL の初期サンプルに追加します。 メーカーの指示に従ってプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加します。 下流の実験(RNAseq、LC-MS、GC-MS-MS、ウェスタン、FACSなど)を直ちに行うか、-80°Cで保管してください。 5. EVの豊富さのフローサイトメトリー定量化 染料調製 新鮮なDMSOを使用してDI-8-ANEPPSの10 mMストックを準備します。10 μL アリコートに配布し、-20 °Cで保管してください。 90 μLの無菌濾過PBSを10 μLの染料ストックを持つチューブに加えて、1 mMの作業ソリューションを準備します。 実験サンプル調製 840 μL の S 基底溶液をマイクロ遠心分離チューブに加えます。その後、セクション4.2と渦で生成された精製EVの60μLを加えます。 サンプルのアリコート300 μLを2つの新しいマイクロ遠心チューブに取り込んだ。300 μLの希釈EVを含む3本のチューブの実験セットが、現在あります。チューブにラベルを#1-3.サンプル#2に、#35.1.2で調製したDI-8-ANEPPSストックの7 μLを追加します。その後、1%トリトンX 100の7μLをチューブ#3に加えます。各チューブを渦で混ぜます。 超音波処理サンプル#3、超音波処理器の先端をサンプルの中央に配置し、20%の電力30%デューティサイクルで10回脈動します。注意:発泡器の生成が最小限に抑えられるように、超音波器プローブの先端がサンプルの真ん中にあることを確認してください。フォームは、EV を集約させることによってサンプルを損なう可能性があります。 S基底溶液300μLを2本のマイクロ遠心チューブに加えます。ステップ5.1で調製したDI-8-ANNEPS作動試薬の7μLを第2のチューブに加え、ラベル「染料のみ」にします。他のチューブに「バッファのみ」というラベルを付けます。注: 同じ S 基底ソースを使用して、色素のみおよびバッファーのみ制御サンプルと実験サンプルを準備します。 直接光から離れて、室温で1時間、サンプルをインキュベートします。 FACS 実験を実施します。 FACS励起フィルタを488 nm(青)に、エミッションフィルタを605 nm(オレンジ)に設定します。流量を1分あたり1.5μLに設定します。 ナノビーズ FACS キャリブレーション ミックスを実行します (オプションですが推奨)。 FACS マシン上で各サンプルを 3 分 (180 s) 実行します。正確な実行時間を秒単位で書き留めます。 FACS データを分析します。 FACS 解析ソフトウェアでファイルを開きます。 [軸] をクリックして Y 軸を488 組織 (エリア)に切り替えます。 SALS レベル 102から 104 (<300 nm サイズのパーティクル) に及ぶ、プロットの上部から始まる長方形のゲートを設定します。ゲートのイベント全体の 2.5% が含まれるまでゲートを下方まで延長します。ゲートに「DI-8-ANEPPS+」イベントの名前を付けます。 サンプルEVの量の定量化 このゲートをコピーして、実験セットの他の 2 つのサンプルと[バッファーのみ]および[仕分けのみ]コントロールに貼り付けます。分析をスプレッドシートにエクスポートします。 推奨される 3 分 (180 秒) に FACS サンプルを実行しなかった場合は、サンプル内のすべてのイベント カウントを 180 秒あたりのイベントに正規化します。例えば、サンプルが 250 s で実行された場合、DI-8-ANEPPS+ イベント番号は 250 s/180 s でスケールされます。 サンプル#2の DI-8-ANEPPS+ コントロールの DI-8-ANEPPS+ イベント数を減算して、色素バックグラウンド イベントを削除します。 サンプル #1の DI-8-ANEPPS+ イベントの数を減算して、アイソタイプバックグラウンド イベントを削除します。 サンプル#3の DI-8-ANEPPS+ イベントの数を減算して、洗剤に依存しないイベントを除去します。この値は、ボナ・フィデスのEVの数です。 サンプルの1μL内のEVの数を、ステップ5.5.5で計算した値をμLで分析した体積(ステップ5.3で分析した4.5 μL)で割り、希釈係数(ステップ2.5で説明した10倍)で乗算することで計算します。この値に、EV 準備の残りの μL 数を掛けます。これは、ダウンストリーム解析に使用できる EV の数です。 図2:EVの存在量を定量するフローサイトメトリーサンプル調製の概略図。(A)EV製剤は、3つの同一のサンプルに分かれています。サンプル#1は、染料なし陰性対照です。その後、DI-8-ANEPPSをサンプル#2に添加し、#3します。トリトン-X 100は、サンプル#3に追加されます。緑色の矢印は、サンプル#3だけがその後超音波処理されることを示します。フローからのデータは、FACS サンプル内の洗剤に敏感な EV の絶対数を決定し、合計準備で EV の量を計算するのに役立ちます。色素陽性事象を決定するためのゲートは、染料を含みないサンプル#1で設定されます。スプレッドシートデータに赤で書き込むのは、洗剤処理サンプルからの色素陽性事象が色素でサンプルから差し引かれることを示す。(B) FACS で EV を定量化し、サンプル内の EV の総数を計算するための方程式。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。